Diretrizes para Submissão de Amostras
Deteção de Contaminação de Alta Sensibilidade. Ao contrário da verificação básica, a nossa plataforma deteta contaminação cruzada de baixo nível (até 10%) ao identificar padrões multi-alélicos que os ensaios standard não conseguem captar.Por que a Validação de Linhas Celulares é Importante?
Na era da medicina de precisão, a reprodutibilidade dos dados científicos é inegociável. No entanto, a má identificação de linhagens celulares continua a ser uma "epidemia silenciosa" em laboratórios em todo o mundo. Estatísticas do Comité Internacional de Autenticação de Linhagens Celulares (ICLAC) e de outros organismos indicam que aproximadamente 18% a 30% das linhas celulares atualmente utilizados na pesquisa estão ou cruzadamente contaminados ou totalmente mal identificados.
Este problema generalizado surge normalmente de:
- Contaminação Cruzada: Linhagens celulares de rápido crescimento (como HeLa) introduzidas acidentalmente em culturas de crescimento mais lento.
- Rotulagem incorreta: Erros durante a cultura celular de rotina, criopreservação ou transporte.
- Deriva Genética: Instabilidade em linhas celulares passadas por períodos prolongados.
O Panorama Regulatório: Mandatos para a Profilagem de STR
Para combater isto, a autenticação já não é opcional—é uma exigência.
- Requisitos da Revista: Os principais editores (Nature, Cell, Science, revistas da AACR) agora exigem prova de autenticação de linhagens celulares como pré-requisito para a aceitação de manuscritos.
- Agências de Financiamento: O NIH e outros organismos de concessão de subsídios exigem planos de autenticação para candidaturas a subsídios que envolvam linhas celulares.
- Orientação da FDA: Para o desenvolvimento de produtos terapêuticos, a FDA recomenda a caracterização de STR em etapas chave: cultura inicial (primeira semana), antes da criopreservação e periodicamente (a cada 2 meses) durante a cultura ativa.
CD Genomics capacita-o a cumprir estes padrões sem esforço. Ao integrar os nossos serviços de autenticação no seu fluxo de trabalho, protege a validade do seu projeto, garantindo que as suas conclusões são baseadas no modelo biológico correto.
Quando Precisamos de Identificação de Linhas Celulares?
Para garantir a precisão e fiabilidade da investigação baseada em células, a autenticação deve ser realizada nas seguintes situações recomendadas:
- No início ou conclusão de um projeto de investigação envolvendo experiências baseadas em células.
- Antes da criopreservação ou após as células terem estado em cultura contínua durante 2-3 meses.
- Antes de submeter a pesquisa para publicação ou de candidatar-se a financiamento de bolsas.
- Se as linhas celulares apresentarem um desempenho instável ou resultados significativamente divergentes das expectativas.
- Sempre que várias linhas celulares são utilizadas num laboratório, é fortemente recomendado autenticar todas as linhas para excluir a possibilidade de contaminação cruzada.
Superioridade Técnica: A Diferença da CD Genomics
O nosso serviço de Identificação de Linhas Celulares é baseado numa fundação de rigor e excelência tecnológica. Não realizamos apenas uma PCR; oferecemos uma solução abrangente de verificação de identidade.
1. Ultra-Alta Sensibilidade e Conservação de Amostras
Entendemos que alguns modelos celulares são difíceis de cultivar ou limitados em quantidade. O nosso protocolo otimizado requer apenas um template mínimo de 1 ng de DNA. Isso permite que você autentique células primárias de passagem inicial ou linhas de crescimento lento sem expandi-las apenas para fins de controlo de qualidade. Além disso, a nossa plataforma alcança um Taxa de deteção de contaminação cruzada de 10%Esta sensibilidade é crucial para identificar contaminação em "estágios iniciais", onde uma linha celular invasiva (como a HeLa) está apenas a começar a ultrapassar a sua cultura-alvo.
2. Cobertura Abrangente de Espécies e Locus
Oferecemos um dos portfólios mais versáteis da indústria, cobrindo 95% dos modelos de pesquisa comuns.
- Analisamos 20 loci STR além do marcador de género Amelogenin. Isto excede os painéis padrão de 8 loci utilizados por muitos concorrentes, oferecendo um maior poder de discriminação para linhas intimamente relacionadas.
- Rato: Painel de 18 locos validado, projetado para diferenciar entre linhagens celulares únicas de rato.
- Macaco Verde Africano (Vero): Painel especializado de 10 locos (8 STR + 1 Marcador + Género).
3. Dados Robustos e Reproduzíveis
Os nossos fluxos de trabalho são compatíveis com os principais instrumentos de eletroforese capilar, garantindo que os nossos dados sejam diretamente comparáveis aos padrões globais. Nós fornecemos Resultados 100% reproduzíveis, fornecendo dados em que pode confiar para submissões regulatórias ou pedidos de patente.
Opções de Serviço: Estratégias de Identificação Personalizadas
Classificamos os nossos serviços para atender a necessidades de pesquisa específicas, desde a verificação básica de origem até a triagem complexa de contaminação entre espécies.
1. Autenticação de STR de Linhas Celulares Humanas
Público-alvo: Investigadores a submeter artigos a revistas ou a estabelecer bancos de células.
Metodologia: PCR multiplex seguido de Eletroforese Capilar (20 loci STR + Amelogenina).
Entregáveis:
- Perfil STR completo (tabela de alelos).
- Correspondência de Base de Dados: Comparamos o seu perfil com os principais repositórios (ATCC, DSMZ, JCRB, COG) para confirmar a identidade.
- Análise de Contaminação: Detecção de padrões multi-alélicos indicando mistura com outra linha humana.
2. Teste de Variação de Linhas Celulares (Humano)
Público-alvo: Laboratórios a monitorizar a deriva genética ou a comparar clones derivados de dadores.
Metodologia: Perfilagem STR Comparativa (20 + 1 loci).
Aplicação: Este serviço compara duas amostras específicas (por exemplo, "Passagem 5" vs. "Passagem 50") para determinar se são geneticamente idênticas ou se ocorreu uma deriva/mutação significativa.
3. Autenticação de Linhagens Celulares de Rato
Público-alvo: Investigadores em Imunologia e Oncologia a utilizar modelos murinos.
Metodologia: Perfilagem de STR específica de rato (18 loci + 2 marcadores de espécies).
Característica Principal: Este ensaio serve um duplo propósito. Gera uma identificação genética única para a linhagem de ratos. e screening simultaneamente para contaminação cruzada humana usando primers específicos da espécie.
Interpretação:
- Não contaminado: Picos simples ou duplos em todos os 18 loci de rato.
- Contaminado: Presença de picos humanos ou três ou mais picos em loci de rato (indicando mistura de rato com rato).
Autenticação da Linha Celular de Macaco (Vero)
Público-alvo: Desenvolvedores de vacinas e laboratórios de virologia.
Metodologia: Perfilagem STR específica de Vero (8 loci + 1 marcador de espécie + 1 marcador de género).
Aplicação: Confirma a identidade de Chlorocebus aethiops (Macaco Verde Africano) linhas e deteta contaminação de células humanas ou de outros primatas não Vero.
5. Testes de Contaminação de Espécies (Triagem Interspecífica)
Público-alvo: Instalações ou laboratórios centrais que lidam com múltiplos modelos animais.
Metodologia: PCR multiplex com primers específicos para espécies.
Âmbito: Detetamos a presença de DNA estrangeiro de um amplo espectro de 15 espécies:
Roedores: Rato, Rato-toupeira, Hamster Chinês, Hamster Sírio.
Primatas: Humano, Macaco Verde Africano, Macaco Rhesus.
Doméstico/Quinta: Cão, Gato, Bovino, Suíno, Coelho, Cavalo, Ovelha, Cabra.
Fluxo de Trabalho do Serviço de Identificação de Linhas Celulares
Otimizar o nosso processo para minimizar o seu esforço e maximizar a velocidade dos dados.
Consulta de Projeto: A nossa equipa técnica confirma o seu tipo de célula e seleciona o painel STR apropriado.
Controlo de Qualidade (CQ) de Amostras: Verificamos a quantidade e integridade do seu DNA ou pellet celular aquando da receção para garantir uma amplificação bem-sucedida.
Amplificação da Região STR: Utilizando primers marcados com fluorescência, amplificamos as regiões microsatélites alvo.
Análise de Fragmentos: A eletroforese capilar separa os produtos de PCR com resolução de um único par de bases.
Análise de Dados e Relatórios: Os nossos bioinformáticos interpretam os picos, realizam correspondência de bases de dados e geram um relatório PDF abrangente.
Figura 1. O Fluxo de Trabalho de Autenticação da CD Genomics.
Requisitos de Amostra para Identificação de Linhagem Celular
| Tipo de Amostra | Requisitos de Submissão | Condições de Envio |
|---|---|---|
| Pelote de células ou suspensão | ≥5×10⁵ células, volume: 18 μL – 2 mL | Enviado com pacote de gelo Enviado com bolsa de gelo |
| DNA genómico | Concentração ≥50 ng/μL, volume ≥20 μL |
Dicas:
- Envie amostras em gelo azul para preservar a integridade.
- Serviços de extração de DNA disponíveis mediante solicitação.
- Para tipos de amostras especiais ou cenários de baixo input, entre em contacto connosco para um plano personalizado.
Guia Especializado: Interpretar o Seu Relatório STR
Compreender os seus dados é fundamental. Aqui está como interpretar os resultados fornecidos pela CD Genomics.
1. O Perfil "Limpo" (Homozigoto/Heterozigoto)
Uma linha celular pura exibirá um ou dois picos em cada locus STR.
- Um Pico: A célula é homozigótica neste locus (herdando o mesmo comprimento de alelo de ambos os progenitores).
- Dois Picos: A célula é heterozigótica (herdando diferentes comprimentos de alelos).
2. O Perfil "Contaminado" (Multi-Alelico)
Se a análise revelar três ou mais picos em múltiplos loci, este é o sinal distintivo de contaminação cruzada.
- A Ciência: A altura do pico reflete a quantidade de ADN. Numa mistura, a linha celular "dominante" mostrará picos altos, enquanto o "contaminante" (por exemplo, HeLa) aparecerá como picos secundários menores.
- Limite: Se >2 alelos forem encontrados em ≥ 3 loci (para rato) ou em múltiplos loci (para humano), a amostra é sinalizada como contaminada.
3. A Pontuação do Jogo
- ≥ 80% Correspondência: A linha celular está autenticada. Este limiar permite uma pequena deriva genética comum em células cultivadas.
- < 80% Correspondência: A linha celular está provavelmente mal identificada ou significativamente desviada geneticamente. Recomenda-se ação imediata (descartar a linha ou reabastecer).
Demonstração
Autenticação da Linha Celular de Rato: O objetivo é confirmar a identidade da linha celular como sendo de rato e detetar qualquer contaminação potencial por humanos.
Interpretação dos Resultados:
· Células de Rato Normais e Não Contaminadas: Nenhum pico detetado em loci humanos, e todos os 18 loci de rato apresentam picos simples (homozigóticos) ou picos duplos (heterozigóticos).
· Contaminação Cruzada entre Ratos: Nenhum pico detetado em locos humanos, mas pelo menos três dos 18 locos de rato mostrarão três ou mais picos.
Distribuição da qualidade da base.
Análise de Contaminação de Linhas Celulares Humanas: Utilizamos um sistema de perfilagem STR de 20 locos para detetar contaminação cruzada em linhas celulares humanas.
Interpretação dos Resultados: A análise mostra um padrão tri-alélico nos loci D6S1043, D3S1358, D13S317 e TPOX. Isto indica que a linha celular é uma mistura de células humanas, confirmando a contaminação cruzada de duas fontes celulares humanas distintas.
Perguntas Frequentes
1. Qual a linha celular que mais comumente contamina outras?
As células HeLa apresentam o maior risco de contaminação. Amplamente utilizadas em investigação médica e biológica há mais de 50 anos, o rápido crescimento das HeLa permite que estas superem facilmente outras culturas. Se as células em um frasco começarem a proliferar agressivamente e forem posteriormente passadas, há uma alta probabilidade de contaminação por HeLa. Notavelmente, já em 1967, o geneticista Stanley Gartler identificou linhas celulares populares como HEp-2 e INT 407 como derivados de HeLa.
2. Quais linhas celulares foram contaminadas por HeLa?
Casos documentados de contaminação por HeLa incluem mais de 100 linhas celulares, como: INT-407, HEp-2, WISH, Acc-M, Bcap-37, HAC-84, Hepatoma, HUL-42, CNE, SPC-A-1, Tca-8113 e YTMLC.
3. Como é verificada a identidade da linha celular?
A autenticação segue os padrões do Comité Internacional de Autenticação de Linhagens Celulares (ICLAC). Isto envolve a análise de PCR fluorescente multiplex de 8 loci STR humanos e 1 locus amelogenina determinante de género. Perfis genéticos detalhados para estes marcadores são fornecidos na tabela abaixo.
4. Como é que a contaminação cruzada é detetada através do perfilamento STR?
A contaminação cruzada é identificada pela presença de múltiplos picos (mais de dois alelos) em vários loci de STR. A altura do pico correlaciona-se com a concentração de DNA; assim, em amostras mistas, a linha celular principal exibe picos dominantes, enquanto o contaminante mostra picos menores. Notavelmente, padrões multi-alélicos podem imitar instabilidade genética, que é comum em subpopulações de células cancerígenas. A interpretação especializada por biólogos moleculares experientes é essencial para diferenciar a verdadeira contaminação da heterogeneidade genética intrínseca.
5. Como é confirmada a identidade da linha celular utilizando dados de STR?
O perfil STR da amostra é comparado a bases de dados de referência. A identidade é confirmada se ≥80% dos alelos corresponderem ao perfil de referência em todos os locos. Correspondências abaixo de 80% indicam potencial rotulagem incorreta, contaminação ou deriva genética. Se a contaminação ou a identificação incorreta forem confirmadas, autentique as estirpes de passagens anteriores ou adquira uma nova linha de uma fonte certificada.
6. E se não for encontrada nenhuma correspondência na base de dados?
Se nenhum perfil de referência for encontrado, estabeleça uma assinatura genética única para a sua linha celular. Este perfil base permitirá a autenticação futura em relação ao seu banco de células interno.
7. Que impacto têm as células mal identificadas ou contaminadas cruzadamente na investigação?
O impacto é significativo. O uso de células comprometidas desperdiça tempo, recursos e financiamento, levando frequentemente a resultados irreproduzíveis ou inconsistentes. Estudos realizados com essas linhagens celulares podem necessitar de repetição com células autenticadas antes da publicação ou do desenvolvimento adicional.
