Diretrizes para Submissão de Amostras
Serviço de Sequenciação de Isoformas de Células Únicas
A sequenciação de isoformas a partir de células únicas está a transformar o campo de transcriptómica ao fornecer informações sem precedentes sobre a expressão e regulação gênica com resolução a nível de célula única. Esta abordagem sofisticada é indispensável para elucidar processos biológicos complexos e mecanismos de doenças que frequentemente são obscurecidos pelo sequenciamento de RNA em massa tradicional.
A CD Genomics está a liderar esta fronteira inovadora ao fornecer serviços de sequenciação de isoformas de célula única de última geração. Através da utilização de tecnologias avançadas, como o PacBio MAS-Seq, a CD Genomics alcança dados de isoformas de alta resolução e comprimento total, avançando assim a nossa compreensão da heterogeneidade celular e da complexidade molecular.
O que é Sequenciação de Isoformas de Célula Única?
A sequenciação de isoformas de célula única (scIso-Seq) destaca-se como uma técnica robusta para dissecção do transcriptoma de células individuais, revelando assim as complexas nuances da expressão génica e das variações de splicing que sustentam a diversidade e a função celular. Em contraste com a sequenciação de RNA convencional, que agrega perfis de expressão génica de uma população de células, o scIso-Seq preserva a heterogeneidade entre células individuais. Este método facilita a identificação de isoformas únicas e variantes de splicing potencialmente cruciais na saúde e na doença, oferecendo uma compreensão mais profunda das bases moleculares dos processos biológicos.
Importância do Sequenciamento de Isoformas em Células Únicas
A complexidade do transcriptoma, definida por vários eventos de splicing e isoformas, influencia significativamente o comportamento e a função celular. Os métodos tradicionais de sequenciação de leituras curtas muitas vezes não conseguem resolver essas complexidades devido à sua incapacidade de capturar transcritos de comprimento total. Em contraste, o scIso-Seq fornece uma visão abrangente de todo o transcrito, desde o local de início de transcrição 5' até a cauda poli-A 3', revelando informações cruciais sobre o uso de exões, junções de splicing e regiões não traduzidas (UTRs). Este nível de detalhe é essencial para uma anotação genética precisa, compreensão dos mecanismos regulatórios e identificação de novos alvos terapêuticos.
PacBio MAS-Seq para Sequenciação de Isoformas de Células Únicas
O Sequenciamento de Arrays Multiplexados da PacBio (MAS-Seq) representa um avanço significativo na tecnologia de sequenciamento de isoformas de células únicas. Ao combinar a síntese de cDNA de comprimento total com capacidades de sequenciamento de leituras longas, o MAS-Seq ultrapassa as limitações dos métodos tradicionais de leituras curtas e melhora a resolução e a capacidade de processamento da transcriptómica de células únicas.
Princípio do MAS-Seq
O MAS-Seq envolve a concatenação de moléculas de cDNA de comprimento completo em fragmentos maiores, que são então sequenciados usando A tecnologia de leitura longa de alta fidelidade (HiFi) da PacBioO processo começa com a geração de cDNA de célula única, seguido pela remoção de oligos de troca de template (TSOs) e pela concatenação de moléculas de cDNA em arrays ordenados. Estes arrays são ligados a adaptadores MAS e sequenciados em plataformas PacBio como os sistemas Sequel II/IIe e Revio.
As leituras HiFi resultantes são segmentadas bioinformaticamente para recuperar as sequências de cDNA originais, garantindo alta precisão e rendimento. Este método elimina a necessidade de fragmentação e montagem de leituras curtas, proporcionando uma visão direta e abrangente do transcriptoma a nível de célula única.
Vantagens do MAS-Seq
- Informação sobre Isoformas de Comprimento TotalO MAS-Seq captura isoformas completas, incluindo todas as regiões exónicas, junções de splicing e UTRs, fornecendo um mapa detalhado do transcriptoma.
- Alto RendimentoA estratégia de concatenação aumenta significativamente o rendimento, permitindo o sequenciamento de múltiplas moléculas de cDNA em uma única corrida. Esta eficiência é particularmente benéfica para estudos em larga escala e tecidos complexos.
- Código de Barras Celular PrecisoO MAS-Seq integra a marcação de células únicas e uma etiqueta única, garantindo a quantificação e identificação precisas de transcritos individuais.
- Custo-EfetividadeAo maximizar a utilização da capacidade de sequenciação, o MAS-Seq reduz o custo por célula e por isoforma, tornando-se uma opção viável para estudos extensivos de células únicas.
- Eliminação da Sequenciação OrtogonalO MAS-Seq fornece dados abrangentes de isoformas de forma independente, simplificando o fluxo de trabalho e reduzindo a complexidade.
- Deteção de Isoformas AprimoradaA capacidade do MAS-Seq de capturar isoformas completas oferece uma visão abrangente dos eventos de splicing alternativo, genes de fusão e outras variações transcriptómicas que frequentemente são perdidas pela sequenciação de leituras curtas.
- Dados de Alta ResoluçãoA tecnologia de leitura longa utilizada no MAS-Seq oferece alta resolução e precisão, permitindo a identificação de alterações transcriptómicas subtis e isoformas raras, essenciais para compreender as funções celulares e os mecanismos da doença.
- Fluxo de Trabalho SimplificadoO MAS-Seq simplifica o fluxo de trabalho de sequenciação, reduzindo o tempo, custo e complexidade dos projetos de sequenciação de isoformas de células únicas.
- Compatibilidade e FlexibilidadeO kit MAS-Seq é compatível com cDNA gerado a partir do sistema 10x Chromium, tornando-o adaptável a várias aplicações de sequenciação de células únicas. A sua flexibilidade permite que os investigadores estudem uma ampla gama de amostras biológicas e condições experimentais.
- Apoio Bioinformático RobustoA PacBio oferece ferramentas de bioinformática abrangentes para o processamento de dados MAS-Seq, incluindo segmentação de leituras, correção de etiquetas únicas e classificação de isoformas. Estas ferramentas garantem uma análise de dados precisa e eficiente, facilitando aplicações e insights subsequentes.
Figura 1. Sequenciação de isoformas resolvidas a nível de célula única de células únicas com MAS-ISO-seq.
Aplicações e Impacto do MAS-Seq
A sequenciação de isoformas de célula única utilizando MAS-Seq tem implicações significativas em vários domínios da investigação biológica e da medicina. No contexto da investigação do cancro, esta tecnologia facilita a identificação de mutações e eventos de splicing específicos de isoformas que estão na base da tumorigénese e da resistência à terapia. Na neurobiologia, permite um exame detalhado da diversidade neuronal e a deteção de variações de isoformas ligadas a distúrbios neurológicos. Além disso, o MAS-Seq revela-se inestimável na genómica de plantas, ajudando na elucidação de transcriptomas complexos em espécies com genomas extensos e diversos.
O nosso Serviço de Sequenciação de Isoformas de Célula Única por MAS-Seq
Na CD Genomics, utilizamos a avançada tecnologia MAS-Seq para oferecer uma resolução sem igual nas análises transcriptómicas. O nosso serviço captura isoformas completas, proporcionando uma compreensão abrangente do splicing alternativo, eventos de fusão de genes e outras variações transcriptómicas frequentemente obscurecidas por métodos de sequenciação convencionais.
Além das nossas sofisticadas capacidades de sequenciação de isoformas, estamos comprometidos em oferecer sequenciação de RNA de célula única de alta qualidade, sequenciação de DNA de célula única, sequenciação de metilação de DNA de célula única e sequenciação de célula única 10X Genomics. Esta plataforma multifacetada permite-nos atender a um amplo espectro de necessidades de investigação, fornecendo informações detalhadas sobre a expressão génica, variações genéticas e modificações epigenéticas ao nível da célula única.
Fluxo de Trabalho e Conteúdo da Análise de Dados MAS-Seq
| Passo | Descrição | Detalhes |
|---|---|---|
| Pré-processamento de Dados | Converter os dados de MAS-Seq para um formato de análise utilizável e adicionar metadados relevantes. | - Bibliotecas de captura de RNA e de captura de anticorpos quantificadas e processadas. - Abordou a identificação de células conservadoras para reter mais gotículas viáveis. - Removidos células não imunes e dupletas. - Contagens de captura de anticorpos transformadas em log para análise posterior. |
| Integração de Dados | Integre dados de long-read e short-read para garantir consistência e uma análise conjunta de alta qualidade. | - Matrizes de contagem a nível de isoforma convertidas para análise. - Mapeou transcrições de romances e genes para anotações conhecidas. - Transcrições ambíguas marcadas e genes de recetores cruzados. - Conjuntou conjuntos de dados ao reter códigos de barras celulares mútuos, alcançando alta fidelidade de identificação. |
| Normalização, Agrupamento e Embedding | Normalize os dados, identifique características altamente variáveis e realize uma análise de clustering. | - Aplicou transformação de estabilização de variância aos contagens. - Selecionados os principais genes/isoformas como características altamente variáveis. - Conjunto de características reduzido utilizando análise de componentes principais. - Construído gráfico de vizinhos mais próximos para incorporação e agrupamento. - Realizou análise de expressão gênica diferencial. |
| Análise de Expressão Diferencial | Identificar genes de expressão diferencial entre diferentes tipos de células e anotar populações celulares. | - Realizou análise de expressão diferencial para identificar diferenças de expressão entre diferentes tipos de células. |
| Análise da Trajetória Evolutiva | Utilize a análise de pseudotempo de difusão (DPT) para mapear os caminhos de desenvolvimento celular. | - Realizou análise de pseudotempo de difusão para determinar transições de estado celular. - Utilizou contagens transformadas para uma representação gráfica mais limpa. |
| Refinamento da Anotação da Isoforma CD45 | Refinar as anotações GENCODE para melhorar a especificidade das atribuições de isoformas. | - Anotações genéticas incompletas refinadas - Melhorou a especificidade para atribuições de isoformas utilizando métodos aprimorados. - Utilizou uma atribuição baseada em decisões para detecção precisa de isoformas. |
| Identificação de Genes Alternativamente Espalhados | Realize testes estatísticos de splicing diferencial globais e resolvidos por cluster para identificar o uso diferencial de isoformas entre populações celulares. | - Realizou testes de splicing diferencial global e testes de splicing diferencial resolvidos por clusters para identificar o uso diferencial de isoformas em diferentes clusters celulares. - Valores p ajustados para a taxa de descoberta falsa (FDR) para garantir robustez estatística. |
Fluxo de Trabalho do Nosso Serviço
Preparação de Amostras: Suspensões de células únicas são preparadas e processadas utilizando o kit 10x Chromium Next GEM Single Cell 3' para gerar cDNA.
Síntese e Purificação de cDNA: Moléculas de cDNA de comprimento completo são sintetizadas e purificadas para remover oligonucleotídeos de troca de template (TSOs).
Concatenação e Ligação de Adaptadores: as moléculas de cDNA são concatenadas em arrays ordenados, e os adaptadores MAS são ligados para facilitar o sequenciamento.
Sequenciação de Longas Leituras: As bibliotecas de cDNA preparadas são sequenciadas em plataformas PacBio, como os sistemas Sequel II/IIe ou Revio, gerando leituras longas de alta fidelidade.
Análise de Dados: As leituras HiFi são segmentadas bioinformaticamente para recuperar as sequências de cDNA originais, seguidas de uma análise detalhada do conteúdo de isoformas, splicing alternativo e fusões genéticas.
Figura 2. Fluxo de trabalho MAS-ISO-seq
Requisito de Amostra
Viabilidade Celular: Uma alta viabilidade celular (>90%) é crucial para a geração de bibliotecas de cDNA de célula única de qualidade.
Número de Células: Recomenda-se um mínimo de 1.000 células para alcançar uma cobertura abrangente e uma quantificação precisa de isoformas.
Pureza da Amostra: As amostras devem estar livres de contaminantes e detritos para evitar interferências no processo de sequenciação.
Integridade do RNA: Uma alta integridade do RNA (RIN > 7) é essencial para gerar moléculas de cDNA de comprimento completo.
Como garante a precisão e a qualidade dos dados?
Utilizamos a tecnologia de sequenciação de alta fidelidade da PacBio e ferramentas de bioinformática robustas para garantir alta precisão e qualidade nos nossos dados. Além disso, a nossa equipa de especialistas realiza rigorosos controlos de qualidade ao longo de todo o fluxo de trabalho.
Consegue analisar isoformas raras e de baixa abundância?
Sim, o MAS-Seq é altamente sensível e capaz de detectar isoformas raras e de baixa abundância, proporcionando uma visão abrangente do transcriptoma.
Que tipos de amostras pode processar?
Podemos processar uma ampla gama de amostras de células únicas, incluindo aquelas de tecidos, linhas celulares e células primárias. Por favor, entre em contacto connosco para requisitos e recomendações específicas de amostras.
Qual é o número mínimo de células necessárias para o sequenciamento de isoformas a partir de células únicas?
Para resultados ótimos, recomendamos um mínimo de 1.000 células. Isto garante uma cobertura abrangente e uma quantificação precisa dos isoformas. No entanto, podemos trabalhar com números de células menores se necessário, embora isso possa impactar a profundidade da análise.
Que tipo de plataformas de sequenciação utiliza para sequenciação de isoformas de célula única?
Utilizamos os sistemas PacBio Sequel II/IIe ou Revio para sequenciação de isoformas de células únicas. Estas plataformas fornecem leituras longas de alta fidelidade, garantindo uma análise de isoformas precisa e detalhada.
Como lida com a privacidade e segurança dos dados?
Na CD Genomics, priorizamos a privacidade e segurança dos dados. Todos os dados são armazenados em servidores seguros com acesso restrito, e seguimos protocolos rigorosos de proteção de dados para garantir a confidencialidade das informações dos nossos clientes.
Pode fornecer assistência com a interpretação de dados?
Sim, a nossa equipa de bioinformática especializada está disponível para ajudar na interpretação de dados. Oferecemos apoio abrangente para o ajudar a entender os resultados, incluindo relatórios detalhados e serviços de consulta.
Quais tipos de amostras são compatíveis com o seu serviço de sequenciação de isoformas de célula única?
O nosso serviço é compatível com vários tipos de amostras de células únicas, incluindo tecidos frescos e congelados, linhas celulares e células primárias. Se tiver tipos de amostras específicos, por favor, entre em contacto connosco para recomendações detalhadas.
Que tipo de análise bioinformática você oferece?
A nossa análise de bioinformática inclui correção de tags únicas, classificação de isoformas, análise de splicing alternativo, deteção de fusões genéticas e análise de expressão diferencial. Fornecemos relatórios abrangentes com visualizações para facilitar a interpretação dos dados.
Como devem ser preparados e enviados os amostras?
As amostras devem ser preparadas como suspensões de células únicas com alta viabilidade e pureza. Para o envio, recomendamos o uso de gelo seco e embalagem apropriada para manter a integridade da amostra durante o transporte. Diretrizes detalhadas para a preparação e envio de amostras serão fornecidas mediante solicitação.
O seu serviço consegue identificar isoformas novas?
Sim, o nosso serviço de sequenciação de isoformas de célula única é projetado para identificar novas isoformas. Os dados de alta resolução gerados pelo MAS-Seq permitem a descoberta de isoformas previamente não caracterizadas, aumentando a nossa compreensão do transcriptoma.
O seu serviço é adequado para investigação clínica?
O nosso serviço destina-se exclusivamente a fins de investigação e não é adequado para diagnóstico clínico ou testes. No entanto, é altamente valioso para aplicações de investigação, incluindo investigação sobre o câncer, estudos de doenças raras e medicina personalizada.
Qual é o custo do seu serviço de sequenciação de isoformas de célula única?
O custo do nosso serviço varia dependendo do âmbito do projeto, número de amostras e requisitos específicos. Por favor, contacte-nos para um orçamento detalhado adaptado às suas necessidades.
Oferecem soluções personalizadas para necessidades de pesquisa específicas?
Sim, oferecemos soluções personalizadas para atender a necessidades de pesquisa específicas. A nossa equipa trabalhará consigo para conceber uma abordagem adaptada que responda aos seus objetivos e desafios de pesquisa únicos.
Como posso começar com o serviço de sequenciação de isoformas de célula única da CD Genomics?
Para começar, basta entrar em contacto connosco com os detalhes e requisitos do seu projeto. A nossa equipa fornecerá uma consulta para discutir as suas necessidades e delinear os próximos passos para a submissão de amostras e a iniciação do projeto.
Referência
- Al'Khafaji, A.M., Smith, J.T., Garimella, K.V. et al. Sequenciação de isoformas de RNA em alta capacidade utilizando concatenação de cDNA programada. Nat Biotechnol 42, 582–586 (2024).
