Diretrizes para Submissão de Amostras
Construir um pacote de evidências de QC de DNA/RNA para projetos ABE e CBE.
Os editores de bases são ferramentas poderosas para criar alterações nucleotídicas precisas sem introduzir quebras de dupla hélice. Mas um projeto de ABE ou CBE não deve ser avaliado apenas perguntando se a base pretendida foi alterada no local-alvo. A sua equipa também pode precisar de compreender a janela de edição, edições de acompanhantes, locais de DNA fora do alvo candidatos, sinais de edição ao nível do RNA e como estes resultados diferem entre editores, sgRNAs, doses, pontos de tempo ou grupos de amostras.
A nossa solução de avaliação de segurança de edição de base ajuda-o a organizar estas questões num pacote de evidências de QC suportado por sequenciação. Usamos "avaliação de segurança" num sentido de serviço de investigação: o objetivo é gerar e organizar dados para revisão de projetos, não fazer conclusões clínicas ou regulatórias sobre um editor.
O que esta solução o ajuda a responder.
- O conversão A-para-G ou C-para-T pretendida ocorreu no local alvo?
- Existem edições de espectadores dentro ou perto da janela de edição?
- Os locais fora do alvo do DNA do candidato são editados?
- É necessária uma revisão ao nível do RNA para este editor, tipo de amostra ou fase do estudo?
- Deve-se usar WGS, RNA-seq, sequenciação direcionada ou uma estratégia híbrida?
- Podem ser comparados múltiplos editores, sgRNAs, grupos de tratamento ou pontos de tempo?
- Quais tabelas, figuras e notas de QC são necessárias para a revisão interna do projeto?
O objetivo é ajudar a sua equipa a passar de resultados de sequenciação bruta para um perfil de edição claro que possa ser revisto pelas equipas de biologia molecular, bioinformática e de programas.
Por que a edição de base precisa de mais do que validação do local-alvo
A validação do local-alvo é o ponto de partida. Ela indica se a conversão de bases esperada ocorreu e se existem edições de "bystander" na região alvo. No entanto, os editores de bases também podem levantar questões a nível de DNA e RNA que não são totalmente respondidas por um único ensaio de local-alvo.
Por exemplo, um projeto pode precisar de validação de candidatos direcionados para off-targets de DNA dependentes de sgRNA. Outro projeto pode necessitar de uma revisão suportada por RNA-seq quando a edição a nível de transcriptoma é uma preocupação. Um estudo de comparação de editores de alto valor pode precisar de WGS, RNA-seq, sequenciação direcionada e bioinformática personalizada num único pacote.
Ajudamo-lo a escolher a profundidade de QC que corresponde ao seu objetivo de pesquisa, mantendo a interpretação ligada às evidências de sequenciação e ao contexto do projeto.
As nossas capacidades de serviço para avaliação de edição de base
Apoiamos a avaliação de edição base como um fluxo de trabalho integrado de sequenciação e bioinformática. Dependendo da fase do seu projeto, a nossa equipa pode ajudar a planear a validação no alvo, a caracterização de edições secundárias, a avaliação de desvios de DNA, a revisão a nível de RNA e os resultados de bioinformática prontos para relatório.
Validação em alvo e perfilagem de edição de "bystander"
Para projetos ABE e CBE, a validação em alvo geralmente começa com a conversão base esperada. Os projetos ABE costumam focar na conversão de A para G, enquanto os projetos CBE costumam focar na conversão de C para T. No entanto, a janela alvo pode conter múltiplas bases editáveis, portanto, o resultado deve incluir mais do que uma resposta de sim/não.
- Amplificação de local-alvo ou sequenciação direcionada
- Resumo da eficiência de edição
- Frequência de conversão pretendida
- Editar perfil de espectador
- Padrão de edição a nível de alelo ou de leitura
- Comparação de amostras ou grupos
- Visualização da janela de edição
Descoberta e validação de candidatos fora do alvo de DNA
A revisão de alvos fora do DNA pode ser abordada de diferentes maneiras, dependendo do projeto. Alguns projetos começam com locais candidatos previstos ou identificados experimentalmente. Outros podem necessitar de uma revisão mais ampla suportada por WGS ou abordagens de descoberta específicas de edição de bases, quando disponíveis e apropriadas.
- Revisão da lista de sites candidatos
- Validação direcionada de alvos não específicos
- Sequenciação de amplicon ou sequenciação direcionada
- Contexto de variante suportado por WGS
- Tabela de frequência de edição de candidatos
- Anotação genómica e notas de proximidade genética
- Comparação de amostras controladas e editadas
Revisão a nível de RNA e avaliação suportada pelo transcriptoma
A avaliação a nível de RNA não é necessária para todos os projetos de edição de bases, mas pode ser útil quando o tipo de editor, a fase do projeto ou a questão de pesquisa tornam a revisão a nível do transcriptoma importante. A análise suportada por RNA-seq pode ajudar a rever candidatos à edição a nível de RNA e a comparar amostras editadas com controlos.
- Revisão da QC da amostra de RNA
- Avaliação do transcriptoma suportada por RNA-seq
- Resumo dos eventos de edição de RNA candidatos
- Anotação de transcrição
- Resumo de frequência ou de suporte à leitura
- Comparação de amostras controladas e editadas
- Filtragem de notas e figuras prontas para relatório
Relatório de bioinformática para edição de espectro e evidência de QC
O principal valor desta solução não é apenas a sequenciação. É a interpretação. Ajudamos a organizar edições no alvo, edições de acompanhantes, candidatos fora do alvo de DNA, descobertas ao nível do RNA, anotação de variantes, comparação de amostras e notas de controlo de qualidade em tabelas e figuras que a sua equipa pode rever.
Para serviços relacionados da CD Genomics, consulte o nosso Sequenciação de Validação de Alvos Indesejados do CRISPR, Análise de Edição CRISPR com NGSe Sequenciação de RNA páginas.
Escolha a estratégia de avaliação adequada para ABE, CBE e fase do projeto.
Não existe um único método que responda a todas as questões de QC sobre edição de bases. A estratégia certa depende do tipo de editor, da conversão de bases esperada, do tipo de amostra, do design do controlo, da fase do projeto e de se a sua equipa precisa de evidências a nível de DNA, a nível de RNA ou de evidências em camadas.
| Estratégia | Pergunta Principal | Projeto de Melhor Ajuste | Entrada | Saída | Limitação |
|---|---|---|---|---|---|
| Sequenciação de amplicões em alvo | Foi alcançada a conversão de base pretendida? | Validação precoce, triagem de clones, triagem de amostras | gDNA ou amplicão purificado | Frequência de edição, conversão pretendida, perfil de espectador | Focado na região-alvo selecionada |
| Validação direcionada de off-targets | Os locais fora do alvo do DNA do candidato são editados? | Confirmação do site do candidato | gDNA e lista de locais candidatos | Tabela de frequência de edição de candidatos e anotação | Requer seleção de candidatos |
| revisão suportada por WGS | Existem sinais de variantes genómicas mais amplos? | Revisão de QC a nível de DNA de maior valor | gDNA de alta qualidade | Revisão do contexto de variantes em todo o genoma, CNV/SNV/SV onde aplicável. | Pode não capturar todos os eventos de edição de baixa frequência. |
| revisão suportada por RNA-seq | Estão presentes sinais de edição a nível de RNA? | Avaliação ao nível do RNA e revisão do transcriptoma | RNA total de alta qualidade | Resumo a nível de transcrição e eventos candidatos de edição de RNA | Exige filtragem cuidadosa, controlos e qualidade do RNA. |
| Abordagem de descoberta específica de edição de base | Os eventos induzidos por editores são descobertos além da previsão? | Projetos de descoberta avançada | Entradas de DNA/RNA específicas do projeto | Saída de descoberta de candidatos | A disponibilidade e adequação do método devem ser confirmadas. |
| Estratégia híbrida | Precisamos de evidência em camadas? | Estudos de comparação de plataformas, pré-clínicos ou de editores | DNA, RNA, controlos, informações do editor/sgRNA | Pacote de evidências de QC integrado | Design de projeto mais complexo |
Para uma revisão mais ampla a nível de DNA, o nosso Sequenciação do Genoma Completo o serviço pode ser considerado. Para uma análise focada de alvos ou locais candidatos, Sequenciação de Região Alvo pode suportar validação. Para análise e visualização personalizadas, o nosso Bioinformática a equipa pode apoiar relatórios específicos do projeto.
Comece com o tipo de editor: ABE ou CBE. Em seguida, defina a conversão base esperada, a janela de edição, a sequência-alvo, o sgRNA, o tipo de amostra e o design de controlo. Se o primeiro objetivo for a confirmação do local-alvo, a amplificação ou sequenciação direcionada pode ser suficiente. Se o projeto precisar de contexto a nível de DNA, a sequenciação do genoma completo (WGS) ou validação de off-target direcionada pode ser adicionada. Se a edição a nível de RNA for uma preocupação, uma revisão suportada por RNA-seq pode ser incluída.
Uma estratégia híbrida é frequentemente útil quando as equipas precisam de comparar múltiplos editores, sgRNAs, condições de entrega ou grupos de amostras. Nesses casos, o projeto deve ser concebido com controlos claros e relatar os resultados desde o início.
Fluxo de trabalho de amostra para relatório com pontos de controlo de QC de DNA/RNA
O nosso fluxo de trabalho conecta o ensaio técnico com o processo de serviço. Desde a receção do projeto até à entrega do relatório, cada etapa é concebida para manter a questão da edição de base, o tipo de amostra, o método de sequenciação e o resultado da análise alinhados.
Passo 1: Receção do projeto e revisão das informações do editor
Começamos por rever o tipo de editor, a sequência do sgRNA, a sequência alvo, o PAM, a janela de edição esperada, a conversão de base esperada, o tipo de amostra, os grupos de tratamento, o design da amostra de controlo, os objetivos de QC a nível de DNA e RNA, e os formatos desejados para tabelas, figuras e relatórios.
Este passo ajuda-nos a determinar se o projeto deve concentrar-se na validação do local-alvo, na revisão de DNA candidato fora do alvo, na avaliação ao nível do RNA, na revisão suportada por WGS ou num pacote combinado.
Passo 2: Amostra de recibo e QC de DNA/RNA
Após a receção da amostra, verificamos a identidade da amostra, a rotulagem, o formato do recipiente e os dados de QC disponíveis. Para análises baseadas em DNA, revisamos a quantidade de DNA genómico, a concentração, a pureza e o estado de degradação.
Para a avaliação a nível de RNA, revemos a integridade do RNA, a pureza, o estado livre de DNA e se a qualidade da amostra é adequada para a análise suportada por RNA-seq.
Passo 3: Estratégia de sequenciação em alvo, fora do alvo de DNA e a nível de RNA
A estratégia de sequenciação é selecionada com base na questão do projeto. A validação em alvo pode utilizar sequenciação de amplicões ou sequenciação direcionada. A revisão de DNA fora do alvo pode utilizar painéis de validação direcionados ou métodos de nível de DNA mais amplos. A avaliação a nível de RNA pode utilizar revisão de transcriptoma suportada por RNA-seq.
O objetivo é gerar dados que possam apoiar a produção planeada: frequência de edição, perfil de edição de espectadores, tabela de candidatos fora do alvo, anotação ao nível de DNA/RNA ou comparação de múltiplas amostras.
Passo 4: Chamadas de variantes, análise do espectro de edição e filtragem
Os dados de sequenciação são processados e filtrados de acordo com o método selecionado. A análise pode incluir QC de leituras, alinhamento, revisão da janela-alvo, cálculo da frequência de edição, perfilagem de edições de acompanhantes, revisão de candidatos fora do alvo, anotação de variantes, filtragem a nível de RNA e comparação com controlos.
Nesta fase, focamo-nos em tornar o resultado interpretável, não apenas em produzir listas de variantes.
Passo 5: Relatórios de bioinformática e entregas prontas para revisão
O entregável final pode incluir dados brutos, dados limpos onde aplicável, resumos de QC, gráficos de espectro de edição, tabelas de edição de observadores, tabelas de candidatos fora do alvo de DNA, resumos de eventos a nível de RNA, figuras de comparação de amostras e notas de relatório.
A sua equipa pode utilizar estes resultados para apoiar a revisão interna de investigação, comparação de métodos e planeamento de próximos passos do projeto.
Requisitos de amostra para projetos de avaliação de segurança de edição de base
Os requisitos de amostras dependem de se o seu projeto inclui validação no alvo, avaliação de off-target de DNA, revisão suportada por WGS, avaliação a nível de RNA ou um pacote combinado. A tabela abaixo utiliza as orientações de submissão de amostras da CD Genomics como base para submissões de ácidos nucleicos e células. Os requisitos exatos devem ser confirmados durante a revisão do projeto.
| Tipo de Entrada | Material Recomendado | Verificação de Qualidade | Container ou Formato | Envio ou Submissão | Notas |
|---|---|---|---|---|---|
| Células editadas / pellets de células | Para a submissão geral de células, 1×106 as células são recomendadas | Amostra de identidade, tipo de célula, grupo de tratamento, rendimento de DNA/RNA após extração | Cryovial ou tubo de células congeladas aprovado | Gelo seco | Útil quando a extração de DNA/RNA está incluída. |
| gDNA extraído para validação direcionada | Específico para o ensaio; entradas de leituras curtas ao estilo WES/WGS geralmente começam a partir de ≥500 ng de gDNA. | OD260/280 próximo de 1.8-2.0; tratado com RNase; sem degradação ou contaminação óbvias. | Tubo livre de DNase; água livre de DNase, tampão de eluição ou Tris 10 mM pH 8.0 | Compressas de gelo | Usado para validação no alvo, de acompanhantes ou validação direcionada fora do alvo. |
| gDNA extraído para revisão suportada por WGS | WGS: recomendado ≥500 ng, mínimo 200 ng, mínimo 10 ng/µL; WGS sem PCR: recomendado ≥1 µg, mínimo 500 ng, mínimo 20 ng/µL | Concentração por fluorometria quando possível; se for utilizado o Nanodrop, pode ser necessário um maior volume de entrada. | tubo livre de DNase | Compressas de gelo | Usado para um contexto mais amplo a nível de DNA. |
| Amplicão purificado para validação focada | Sequenciação de amplicons: recomendado ≥1 µg, mínimo 500 ng, mínimo 20 ng/µL | Produto único esperado, se aplicável; verificação de concentração e pureza. | Tubo de baixa ligação ou tubo livre de DNase | Compressas de gelo | Útil para validação do local-alvo ou do local-candidato |
| RNA total extraído para revisão ao nível do RNA | Sequenciação de mRNA: recomendado ≥500 ng, mínimo 200 ng, mínimo 20 ng/µL; sequenciação do transcriptoma completo: recomendado ≥3 µg, mínimo 1 µg, mínimo 20 ng/µL. | RNA total livre de DNA; A260/A280 ≥1,8; A260/230 ≥1,8; RIN ≥6 | Tubo livre de RNase; água livre de RNase, reagente de estabilização de RNA ou Tris 10 mM pH 8.0 | Gelo seco | Usado para revisão do transcriptoma suportada por RNA-seq. |
| Informação do editor e do alvo | Tipo de editor, ABE/CBE, sgRNA, sequência alvo, PAM, edição esperada, design de controlo | Precisão da sequência e consistência do grupo | FASTA, GenBank, folha de cálculo ou folha de projeto | Submissão eletrónica | Requerido antes da revisão do método |
A CD Genomics pede aos clientes que enviem um formulário de submissão de amostras preenchido, assegurando que os nomes das amostras correspondam aos rótulos nos tubos, e que forneçam dados de QC eletrónicos quando disponíveis. Amostras de DNA dissolvidas em H2O ou tampão TE devem ser transportadas com pacotes de gelo, enquanto amostras de RNA, células, bactérias e tecidos congelados devem ser rapidamente congeladas e transportadas com gelo seco. A linha de base geral para a submissão de células é 1×10.6 células e a orientação para tecido fresco congelado lista 10 mg com envio em gelo seco. Estes valores são da orientação de submissão de amostras da CD Genomics.
Análise bioinformática e entregáveis
A bioinformática é central para esta solução. A avaliação da edição de bases torna-se útil apenas quando os dados de sequenciação são convertidos em espectros de edição, resumos de frequência, tabelas de possíveis alvos fora do alvo, anotações a nível de DNA/RNA e notas de controlo de qualidade prontas para relatório.
Entregas mínimas
- Resumo de informações do projeto e da amostra
- Resumo de QC de sequenciação
- Frequência de edição no alvo
- Perfil de conversão pretendido
- Resumo da edição do espectador
- Tabela de off-target de DNA do candidato onde incluído
- Anotação de variantes e contexto genómico onde incluído
- Resumo da edição a nível de RNA onde está incluído o RNA-seq.
- Tabelas de comparação de amostras
- Notas de relatório e ficheiros de visualização
Complementos opcionais
- Análise da janela de edição específica de ABE/CBE
- anotação de locais candidatos dependentes de sgRNA
- Revisão de variantes genómicas em larga escala suportada por WGS
- Revisão sobre edição a nível de transcriptoma suportada por RNA-seq
- Validação profunda do site do candidato
- Comparação de amostras controladas e editadas
- Comparação de múltiplos editores ou múltiplos sgRNA
- Visualização personalizada pronta para figuras
- Registro de parâmetro do pipeline
Um relatório útil deve ajudar a sua equipa a comparar amostras, não apenas a arquivar ficheiros de sequenciação. Os resultados podem incluir gráficos de conversão de bases, tabelas de edição de observadores, resumos de candidatos fora do alvo de DNA, resumos de eventos a nível de RNA, ficheiros de anotação e notas do relatório final.
Isto ajuda equipas de biologia molecular, bioinformática e programação a discutir o mesmo pacote de evidências.
Cenários de aplicação para QC de edição de base
Estes cenários de aplicação mostram como o controlo de qualidade de edição de base suportado por sequenciação pode ajudar as equipas a comparar candidatos a editores, organizar evidências de DNA/RNA e planear a investigação dos próximos passos.
Comparação de candidatos ABE
Os projetos ABE podem exigir a comparação da eficiência de edição, edições de espectadores, alvos fora do alvo de DNA candidato e sinais ao nível de RNA entre versões de editores, sgRNAs ou condições de entrega. Um pacote de QC estruturado ajuda a sua equipa a comparar candidatos utilizando saídas consistentes.
Comparação de candidatos CBE
Os projetos de CBE podem necessitar de uma revisão cuidadosa dos padrões de edição C-to-T, do comportamento da janela-alvo, das edições de "bystander" e dos perfis a nível de DNA/RNA. O controlo de qualidade suportado por sequenciação ajuda a organizar estes resultados em tabelas e figuras interpretáveis.
Programas de investigação em terapia celular e genética
As equipas de investigação em terapia celular e genética podem precisar de evidências em camadas antes de escolher um candidato a editor de base para estudo adicional. Uma estratégia combinada pode incluir validação do local-alvo, revisão de off-target de DNA, avaliação a nível de RNA, comparação de amostras e relatórios de bioinformática.
Estudos de editores de base pré-clínicos e translacionais
Para investigação pré-clínica ou translacional, um pacote de evidências mais completo pode ser útil. Isto pode incluir uma revisão ao nível do DNA suportada por WGS, uma revisão do transcriptoma suportada por RNA-seq, validação de candidatos e figuras prontas para relatório. Os resultados apoiam a revisão da investigação e o planeamento dos próximos passos; não representam uma conclusão de segurança clínica ou regulatória.
Resultados da demonstração: o que um pacote de controlo de qualidade de edição de base pode incluir
Os resultados da demonstração ajudam a sua equipa a compreender como os dados de edição base podem ser organizados. Os exemplos abaixo mostram formatos de resultados comuns que podem ser incluídos quando correspondem ao desenho do estudo.
Demonstração 1: Espectro de edição no alvo e perfil de edição colateral
Um espectro de edição no local-alvo pode mostrar a conversão de base pretendida, a frequência de edição, a posição da base, o suporte de leitura e edições de espectador dentro da janela de edição. Isso ajuda a sua equipa a ver se o padrão de edição observado corresponde ao objetivo de design.
Uma visualização típica pode incluir um gráfico de posição base, uma tabela de alelos ou níveis de leitura, e um gráfico de comparação de amostras.
Demonstração 2: Tabela de candidatos a off-target de DNA e anotação
Uma tabela de candidatos a off-target de DNA pode mostrar a sequência do local candidato, coordenada genómica, frequência de edição, gene próximo, característica genómica e comparação de grupos de amostras. Este formato ajuda a sua equipa a rever os locais candidatos em contexto biológico, em vez de ler uma lista bruta de variantes.
Onde for adequado, os locais candidatos podem ser priorizados para validação mais aprofundada ou análise de acompanhamento.
Demonstração 3: Resumo da edição a nível de RNA e revisão do transcriptoma
Quando a avaliação a nível de RNA é incluída, o relatório pode mostrar eventos candidatos de edição de RNA, anotação de transcritos, suporte de leitura, notas de filtragem e comparação entre amostras de controlo e editadas.
Uma saída típica pode incluir uma tabela a nível de transcrição, um mapa de calor ou um gráfico de resumo mostrando candidatos de edição a nível de RNA entre as amostras.
FAQ: planeamento de um projeto de avaliação de segurança da edição de base
1. A avaliação ABE é diferente da avaliação CBE?
Sim. Os projetos ABE e CBE envolvem diferentes conversões de base esperadas, janelas de edição e possíveis perfis de edição. A estratégia de avaliação deve começar com o tipo de editor, sequência-alvo, edição esperada e objetivo do projeto.
2. A validação em alvo é suficiente para um projeto de edição de base?
Às vezes, pode ser suficiente para triagens precoces. Para projetos de maior valor, a sua equipa pode também precisar de perfis de edição de intervenientes, revisão de candidatos fora do alvo de DNA, revisão suportada por WGS, avaliação a nível de RNA ou um pacote de QC híbrido.
3. O que são edições de espectadores?
Edições de observadores são alterações adicionais na base que ocorrem perto da edição pretendida, muitas vezes dentro ou perto da janela de atividade do editor. Podem ser relevantes se afetarem a sequência final, a região codificadora de proteínas, a região reguladora ou a interpretação do projeto.
4. Devem ser analisados tanto os perfis de off-target de DNA como os perfis a nível de RNA?
Nem sempre. A necessidade depende do tipo de editor, tipo de amostra, fase de pesquisa e preocupação do projeto. A revisão de off-target de DNA pode focar em locais genómicos candidatos ou contexto suportado por WGS. A revisão a nível de RNA pode ser adicionada quando a edição a nível do transcriptoma é relevante.
5. Quando deve ser adicionada a WGS ao controlo de qualidade da edição base?
O WGS pode ser útil quando é necessário um contexto mais amplo a nível de DNA, como para comparação de editores candidatos, amostras de investigação de maior valor ou projetos que requerem uma revisão de variantes em todo o genoma. Deve ser combinado com validação direcionada quando são necessárias evidências de frequência de edição focadas.
6. Quando deve ser adicionado o RNA-seq?
A RNA-seq pode ser considerada quando os sinais de edição a nível de RNA fazem parte da questão de investigação, quando o tipo de editor levanta preocupações a nível do transcriptoma, ou quando o projeto requer uma comparação entre o transcriptoma de controlo e o editado.
7. Que tipos de amostras podem ser utilizados?
Os projetos podem utilizar células editadas, pellets celulares, gDNA extraído, RNA extraído, amplicões purificados ou ficheiros de projeto submetidos, como tipo de editor, sgRNA, sequência alvo, PAM e edição esperada. A entrada exata depende da estratégia de análise selecionada.
8. Que informações sobre o editor e o sgRNA devo fornecer?
Informação útil inclui o tipo de editor, versão ABE/CBE se conhecida, sequência sgRNA, sequência alvo, PAM, conversão de base esperada, janela de edição, grupos de amostras, design de controlo e lista de potenciais alvos fora do alvo, se disponível.
9. Pode comparar múltiplos editores, sgRNAs ou grupos de amostras?
Sim. Um projeto de comparação pode organizar a frequência de edição, o perfil dos observadores, os alvos fora do alvo do DNA dos candidatos, eventos a nível de RNA e métricas de controlo de qualidade entre grupos. Um design de controlo claro é importante.
10. Quais saídas de bioinformática podem ser incluídas?
As saídas podem incluir a edição de gráficos de espectro, tabelas de edição de espectadores, tabelas de DNA candidato fora do alvo, resumos de eventos a nível de RNA, resumos de QC de WGS/RNA-seq, figuras de comparação de amostras, arquivos de anotação e notas de relatório.
Estudo de Caso: A edição fora do alvo a nível de RNA pode ser negligenciada sem uma revisão abrangente do transcriptoma.
Caso de literatura pública
Diário: Natureza
Publicado: 2019
DOI: 10.1038/s41586-019-1161-z
Fundo
Este estudo abordou uma questão importante na investigação sobre edição de bases: os editores de bases de DNA podem também criar sinais de edição de RNA em todo o transcriptoma? Na altura, muitas avaliações de edição de bases concentravam-se fortemente em locais-alvo de DNA. O estudo demonstrou por que a análise a nível de RNA pode ser importante quando a edição fora do alvo em todo o transcriptoma é uma preocupação do projeto.
Este caso é relevante para a nossa solução de avaliação de segurança de edição de base porque apoia a necessidade de evidências de controlo de qualidade em camadas. A validação do local-alvo pode confirmar a edição de ADN esperada, mas a revisão a nível de RNA pode revelar sinais de edição adicionais que requerem uma análise separada.
Métodos
O estudo avaliou editores de bases de DNA guiados por CRISPR utilizando uma análise suportada por sequenciação. Os autores utilizaram RNA-seq para perfilar eventos de edição de RNA em todo o transcriptoma, WES para examinar variantes a nível de DNA e sequenciação de amplicons direcionados para validar locais selecionados.
O estudo comparou amostras editadas com controlos e examinou padrões de edição de RNA associados a diferentes condições de edição de bases. Estes métodos suportam a mesma lógica utilizada no controlo de qualidade da edição de bases em camadas: usar a abordagem de sequenciação adequada para a questão específica de evidência.
Resultados
O estudo reportou edição de RNA fora do alvo em todo o transcriptoma induzida por editores de bases de DNA. A RNA-seq revelou sinais de edição de RNA que não seriam capturados pela validação de locais-alvo apenas de DNA. O artigo também fornece informações sobre a disponibilidade de dados para RNA-seq, WES e sequenciação de amplicões direcionados, apoiando o papel de múltiplas camadas de sequenciação na revisão de editores de bases.
Figura 1 apresenta uma análise de SNV de RNA em todo o transcriptoma após a expressão do editor de bases e mostra como o RNA-seq pode revelar sinais de edição a nível de RNA entre amostras.
A Figura 1 da literatura pública mostra como a análise de RNA em todo o transcriptoma pode revelar sinais de edição a nível de RNA que não são capturados pela validação de locais-alvo apenas com DNA.
Conclusão
Este caso apoia um princípio prático de QC: a avaliação da edição de base deve corresponder à questão da evidência. A validação no alvo, a caracterização de edições colaterais, a revisão de off-target de DNA, a avaliação a nível de RNA, as opções de WGS/RNA-seq e a elaboração de relatórios bioinformáticos podem ser combinadas quando o projeto requer evidência em camadas.
Referência
Publicação relacionada ao cliente
A publicação abaixo é relevante para edição de base e análise a nível de RNA. Está listada como uma publicação de cliente relacionada, não como o estudo de caso baseado em figuras.
| Publicação | Jornal / Ano | Etiqueta de Serviço Relacionada | Por Que É Relevante |
|---|---|---|---|
| A edição de base in vivo resgata a ADPKD em um modelo de rato humanizado. | Nature Communications, 2025 | Construção de Bibliotecas de RNA-seq e Sequenciação de RNA-seq | O estudo envolveu edição de base ABE in vivo e análise de edição de base de RNA fora do alvo em todo o transcriptoma; os métodos indicam que a construção da biblioteca de RNA-seq e o sequenciamento foram realizados pela CD Genomics. |
