Diretrizes para Submissão de Amostras
Quando a RNA-Seq a Nível de Gene Não Captura a Complexidade do Transcrito
A RNA-seq padrão é uma ferramenta poderosa para medir a expressão génica, mas as contagens a nível de gene nem sempre mostram como um gene está a ser utilizado. Um gene pode produzir várias isoformas de transcritos, e essas isoformas podem diferir na estrutura de exões, sequência codificante, regiões não traduzidas, elementos regulatórios ou função biológica.
É aí que a descoberta de isoformas e a análise de splicing alternativo podem acrescentar valor. Em alguns projetos, a expressão total do gene parece inalterada, mas a utilização de transcritos muda de maneiras que são relevantes. Uma isoforma pode aumentar, outra pode diminuir, ou um evento de splicing pode alterar a forma como a sua equipa interpreta um gene ou via candidata.
Estas alterações a nível de transcrição podem ser importantes em estudos de regulação genética, estado celular, especificidade tecidual, resposta ao tratamento, resposta ao stress, desenvolvimento e fenótipos complexos.
A sequenciação de RNA de leitura curta pode apoiar a análise de junções de splicing e a quantificação de expressão, mas as leituras curtas muitas vezes não conseguem reconstruir estruturas de transcritos completos com alta confiança. A sequenciação de transcritos de leitura longa fornece uma camada adicional de evidência ao ler moléculas de transcritos mais longas, o que pode ajudar a resolver estruturas de transcritos, novos isoformas e padrões de splicing complexos.
Para muitas equipas de investigação, a questão útil não é apenas se um gene está expresso. A questão mais prática é: quais isoformas de transcritos estão presentes, como são splicadas e como a utilização de isoformas muda ao longo do desenho do estudo?
A nossa solução foi desenvolvida para responder a essa questão através da revisão da estratégia de sequenciamento, avaliação da qualidade do RNA, bioinformática a nível de transcritos, visualização e entregáveis prontos para relatório.
O que esta solução o ajuda a descobrir
A nossa solução de Descoberta de Isoformas e Análise de Splicing Alternativo é projetada para projetos onde a expressão a nível de gene não fornece resolução suficiente.
Novas isoformas e variantes de transcritos
A sequenciação de transcritos de leitura longa pode ajudar a revelar estruturas de transcritos que são difíceis de montar apenas a partir de leituras curtas. Isso pode ser útil quando o seu projeto precisa identificar isoformas novas, refinar anotações genéticas, descobrir variantes de transcritos ou estudar a arquitetura complexa de transcritos em um gene candidato ou em um conjunto de dados a nível genómico.
Para organismos não modelo, plantas, animais ou espécies com anotações incompletas, a descoberta de isoformas pode também melhorar a anotação do transcriptoma e apoiar estudos funcionais subsequentes.
Eventos de splicing alternativo e padrões de splicing
A splicing alternativo pode gerar múltiplas formas de transcritos a partir do mesmo gene. Podemos apoiar a deteção e interpretação dos principais tipos de eventos de splicing.
- Exon skipping
- Retenção de intrões
- Sítios de splicing alternativos 5′
- Sítios de splicing alternativos 3'
- Exões mutuamente exclusivos
- Padrões de splicing complexos, quando suportados pelos dados
Uso diferencial de isoformas em diferentes condições
Um projeto de isoformas útil frequentemente precisa de mais do que uma lista de transcritos. Pode ser necessário saber se diferentes grupos utilizam diferentes isoformas de transcritos do mesmo gene.
Podemos apoiar a quantificação a nível de transcritos e a análise do uso diferencial de isoformas quando o desenho do estudo e os dados o suportam.
Dicas a nível de transcrição para biomarcadores, alvos e vias.
Os resultados de isoformas e splicing tornam-se mais valiosos quando estão ligados à interpretação biológica. Dependendo do seu projeto, podemos relacionar os resultados a nível de transcrito com anotação funcional, enriquecimento de vias, potencial de codificação, famílias de genes, regiões candidatas, revisão de transcritos de fusão ou interpretação multi-ómica.
As Nossas Capacidades de Serviço para Projetos de Isoformas e Splicing
Não tratamos a descoberta de isoformas como um serviço de sequenciação fixo. O plano adequado depende da sua amostra de RNA, espécie, objetivo de pesquisa, desenho do estudo, dados existentes e o nível de detalhe do transcrito que necessita.
A nossa equipa ajuda-o a combinar módulos de sequenciação e análise num fluxo de trabalho que se adapta à sua questão de investigação.
Descoberta de transcritos completos com sequenciação de leitura longa
Quando a estrutura do transcrito completo é central para o seu projeto, o sequenciamento de transcritos de leitura longa pode fornecer evidências diretas entre os isoformas de transcritos. Podemos apoiar projetos que utilizem Sequenciação de Transcritos de Comprimento Total (Iso-Seq) ou Sequenciação de Transcritos de Comprimento Total por Nanoporos para resolver estruturas de transcritos, novas isoformas, padrões de splicing alternativo e anotação de transcritos.
Para projetos que envolvem características de RNA nativo ou questões relacionadas com poli(A), Sequenciação de RNA Direta por Nanoporos, Sequenciação de poliAou estratégias relacionadas com TAIL Iso-seq podem ser consideradas quando apropriado.
Sequenciação de RNA de leitura curta e suporte a transcriptoma híbrido
Leitura curta RNA-Seq, Sequenciação de mRNA, e Sequenciação de RNA Total continuar a ser valiosos para perfilagem de expressão, suporte a junções de splicing e quantificação a nível de grupo.
Em muitos projetos, uma estratégia híbrida é prática. Leituras longas podem ajudar a definir estruturas de transcritos, enquanto leituras curtas podem reforçar a quantificação em conjuntos de amostras maiores.
Splicing alternativo e bioinformática a nível de isoformas
A descoberta de isoformas e a análise de splicing dependem de uma bioinformática cuidadosa. A CD Genomics oferece Análise de Dados Transcriptómicos, Serviço de Análise de Dados de Sequenciação de Longa Leitura, Análise de Dados Genómicose Bioinformática apoio à reconstrução de transcritos, classificação de novos isoformas, deteção de eventos de splicing, quantificação de isoformas, utilização diferencial de isoformas, anotação e visualização.
Integração opcional de multi-ômica, espacial e de célula única
Quando o contexto celular é importante, a interpretação de isoformas pode precisar de se conectar com Sequenciação de RNA de célula únicaanálise de isoformas de célula única, transcriptómica espacial, ou Análise Multi-ÓmicaEstas opções podem ajudar quando os dados de transcriptoma em massa não explicam o uso de isoformas específicas de tipo celular ou diferenças entre regiões de tecido.
Podemos preparar resultados que ajudem a sua equipa a rever e comunicar resultados a nível de transcritos, incluindo diagramas de estrutura de isoformas, tabelas de eventos de splicing, resumos de utilização diferencial de isoformas, gráficos estilo sashimi, faixas de navegador do genoma, matrizes de expressão, tabelas de anotação e relatórios de projeto.
O objetivo é fornecer à sua equipa resultados organizados que sejam mais fáceis de interpretar, reutilizar e discutir.
Estratégia de Tecnologia: Leitura Curta, Leitura Longa, Célula Única ou Híbrida?
Nenhum método de transcriptómica é o melhor para todos os projetos de isoformas ou splicing. A estratégia certa depende da questão que precisa de ser respondida: expressão génica, estrutura do transcrito, características nativas do RNA, utilização de isoformas específicas de tipo celular ou interpretação subsequente.
Um marco de 2024 da Nature Communications, Avaliação abrangente dos métodos de deteção de isoformas de mRNA para dados de sequenciação de long-read, avaliou 13 métodos de 9 ferramentas para a deteção de isoformas de leituras longas. O estudo mostrou que o desempenho da deteção de isoformas pode variar com a profundidade de leitura, a complexidade do transcriptoma, a completude da leitura, o erro de sequenciação, a completude da anotação e a escolha do software.
Essa evidência apoia um ponto importante para o planeamento de projetos: a descoberta de isoformas não é apenas uma decisão de sequenciação. É uma decisão de fluxo de trabalho completo.
| Estratégia | Melhor ajuste | Valor da estrutura do transcrito | Valor da análise de emenda | Valor de quantificação | Sensibilidade da amostra | Necessidades de bioinformática | Notas práticas |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| RNA-seq de leitura curta | Expressão a nível de gene, suporte a junções de splicing, conjuntos de amostras maiores | Limitado para estruturas de transcrição completa | Útil para sinais de fusão a nível de evento | Forte para expressão e quantificação a nível de grupo | Depende da qualidade do RNA e do tipo de biblioteca. | Ferramentas de alinhamento, quantificação, expressão diferencial e eventos de splicing. | Útil quando a expressão génica é o principal objetivo ou quando dados de leituras curtas podem apoiar a descoberta de leituras longas. |
| PacBio Iso-Seq | Descoberta de isoformas de cDNA de comprimento total e refinamento da anotação | Forte para modelos de transcrição completa | Útil para novas isoformas e estruturas de splicing complexas | Pode suportar análise a nível de isoforma dependendo do design. | Requer qualidade adequada de RNA e preparação da biblioteca. | Reconstrução de transcrições, colapso, classificação, anotação | Boa adequação quando estruturas de isoformas completas de alta confiança são centrais. |
| Sequenciação de transcritos completos por nanopore | Estrutura de transcrição de longa duração e descoberta flexível de transcrições completas. | Forte para leituras longas de transcritos e descoberta de isoformas | Útil para análise complexa de splicing e estrutura de transcritos. | Pode suportar a quantificação a nível de transcritos com um design apropriado. | Requer uma revisão cuidadosa da qualidade do RNA/cDNA. | Processamento de leitura consciente de ONT, reconstrução de transcritos, anotação | Boa escolha quando o comprimento da leitura e a evidência de transcritos longos flexíveis são importantes. |
| Sequenciação de RNA Direta por Nanoporos | Análise de RNA nativo e evidência a nível de transcrito sem conversão de cDNA | Útil para leituras de transcrições nativas. | Pode apoiar questões sobre isoformas e características de RNA. | Dependente do projeto | Sensível à integridade do RNA e à qualidade da amostra. | Processamento e interpretação direta ciente de RNA | Útil quando características nativas de RNA, questões relacionadas com o poli(A) ou evidências sem amplificação são importantes. |
| Análise de isoformas a nível de célula única | Uso de isoformas específico por tipo celular e heterogeneidade | Útil quando a diversidade do transcrito depende do estado celular. | Pode revelar padrões de splicing contextuais de células. | Mais complexo e dependente do desenho do estudo. | O manuseio de amostras e a qualidade celular são críticos. | Análise de transcritos e isoformas ciente de célula única | Melhor quando dados em massa ocultam padrões de transcritos específicos do tipo celular. |
| Estratégia híbrida | Descoberta de isoformas de leitura longa mais quantificação de leitura curta | Forte quando leituras longas definem estruturas e leituras curtas suportam a quantificação. | Útil para comparação a nível de grupo no discovery plus. | Forte quando dados de RNA-seq existentes podem ser reutilizados. | Depende de ambos os tipos de dados. | Integração de dados, refinamento de modelo de transcrição, quantificação, utilização diferencial | Útil quando o projeto necessita tanto da estrutura da transcrição como da confiança a nível de grupo. |
Como ajudamos a selecionar a estratégia
Antes de recomendar um fluxo de trabalho, revisamos o seu objetivo de pesquisa, a condição da amostra de RNA, a espécie e o estado de anotação, os dados existentes e as necessidades de entrega. Esta revisão ajuda-nos a construir uma estratégia que se adapte ao projeto, em vez de forçar todos os projetos a seguirem o mesmo fluxo de trabalho de sequenciação.
Fluxo de Trabalho de Ponta a Ponta com Pontos de Controlo de QC de RNA
Desde a revisão da amostra de RNA até à descoberta a nível de transcritos e entrega do relatório final.
Começamos por rever a sua espécie, tipo de amostra, número de amostras, grupos experimentais, fonte de RNA, estado do genoma de referência e a principal questão de investigação. Nesta fase, esclarecemos se o projeto está focado na descoberta de novas isoformas, deteção de eventos de splicing alternativo, anotação de transcritos, utilização diferencial de isoformas, acompanhamento de célula única ou integração com dados de RNA-seq existentes.
A qualidade do RNA é analisada antes da construção da biblioteca. Para a descoberta de transcritos de comprimento total, a integridade do RNA é especialmente importante, pois o RNA degradado pode reduzir a capacidade de reconstruir estruturas de transcritos completas. Se o tipo de amostra ou a qualidade do RNA não corresponder ao fluxo de trabalho planeado, analisamos possíveis ajustes antes de avançar.
Dependendo da estratégia, as amostras são processadas em RNA-seq de leitura curta, sequenciação de transcritos de leitura longa, sequenciação direta de RNA, análise de células únicas ou um fluxo de trabalho híbrido. As leituras são processadas, filtradas, alinhadas ou mapeadas, e utilizadas para a reconstrução de transcritos quando apropriado.
As isoformas conhecidas e novas são classificadas e anotadas. Eventos de splicing alternativo são detetados quando suportados pelos dados. A quantificação a nível de isoforma e a análise de uso diferencial de isoformas podem ser adicionadas quando o desenho do estudo incluir grupos ou condições adequadas.
Recebe ficheiros de saída e um relatório de projeto que resumem o fluxo de trabalho, resultados de QC, lógica de análise e tipos de saída principais. Quando incluídos no âmbito do projeto, podemos preparar diagramas de isoformas, gráficos em estilo sashimi, mapas de calor, faixas de navegador do genoma e resumos prontos para figuras.
Requisitos de Amostra e Informações de Entrada do Projeto
A qualidade da amostra tem um efeito direto na descoberta de isoformas e na análise de splicing alternativo. A integridade do RNA é especialmente importante para fluxos de trabalho de transcritos de leitura longa, uma vez que RNA incompleto ou degradado pode afetar a reconstrução de transcritos.
Os requisitos finais da amostra dependem da espécie, tipo de amostra, qualidade do RNA, plataforma e objetivo do projeto. Antes da confirmação do projeto, a nossa equipa analisa as informações abaixo e recomenda o fluxo de trabalho mais adequado.
| Tipo de amostra ou entrada | O que revemos | Foco na qualidade | Pontos de controlo típicos de QC | Notas |
|---|---|---|---|---|
| RNA total ou RNA poli(A)+ | Fonte de RNA, método de extração, concentração, pureza, integridade, histórico da amostra | RNA de alta qualidade com degradação limitada | Revisão da integridade do RNA, verificação da concentração, verificação da pureza, controlo de qualidade da biblioteca | Melhor para descoberta de transcritos completos e análise de splicing quando a qualidade do RNA suporta o fluxo de trabalho. |
| Dados de RNA-seq de leitura curta | Ficheiros FASTQ/BAM, versão de referência, tipo de biblioteca, metadados do grupo | Compatibilidade com análise e quantificação a nível de transcritos | Verificação de integridade de ficheiros, leitura de QC, revisão de mapeamento, revisão de metadados. | Útil para análise híbrida, expressão diferencial e suporte à quantificação. |
| Dados de sequenciação de transcritos de leitura longa | Fonte da plataforma, qualidade de leitura, comprimento de leitura, rótulos de amostra, versão de referência | Completude da leitura da transcrição e adequação do mapeamento | Revisão do comprimento de leitura, revisão de qualidade, revisão de mapeamento, revisão da reconstrução de transcritos. | Pode apoiar a reanálise, descoberta de isoformas e aprimoramento de anotações. |
| Dados de transcriptómica de célula única ou espacial | Metadados de células ou pontos, agrupamento de amostras, plataforma, anotação de genes, saídas de análises anteriores. | Compatibilidade de contexto celular com interpretação a nível de isoforma | Revisão de metadados, revisão de QC de células/pontos, revisão de viabilidade de integração | Útil quando o tipo celular ou a região tecidual altera a interpretação do isoforma. |
| Material de tecido, célula, planta, animal, microbiano ou ambiental | Método de preservação, qualidade esperada do RNA, viabilidade da extração, fonte da amostra. | Adequação para extração de RNA e sequenciação subsequente | Inspeção de amostras, revisão da viabilidade de extração, QC de RNA após extração. | O suporte à extração pode ser considerado quando a submissão direta de RNA não estiver disponível. |
Análise e Resultados de Bioinformática
O principal valor desta solução não é apenas o sequenciamento. O valor vem de transformar as evidências de transcritos em resultados organizados, reutilizáveis e interpretáveis.
Focamos em resultados que a sua equipa pode realmente utilizar: modelos de transcrição, tabelas de eventos, matrizes de expressão, ficheiros de anotação, faixas de visualização e relatórios que explicam o que foi feito.
Entregas mínimas
- Resumo da QC de dados brutos
- Distribuição do comprimento de leitura e da qualidade de leitura
- Resultados da reconstrução da transcrição
- Catálogo de isoformas de comprimento total
- Classificação de isoformas conhecidas e novas
- Tabela de eventos de splicing alternativo
- Matriz de expressão a nível de isoforma
Add-ons opcionais
- Análise de splicing diferencial
- Deteção de transcritos de fusão
- Análise da poliadenilação alternativa
- Previsão do potencial de codificação
- Anotação funcional e enriquecimento
- Análise de isoformas a nível de célula única
- Integração multi-ómica
Tipos de ficheiros de saída
- Arquivos FASTQ, BAM ou CRAM onde aplicável
- Ficheiros de anotação de transcritos GTF ou GFF
- Sequências de transcritos FASTA
- Tabelas de isoformas e eventos de splicing em TSV ou CSV
- Matriz de expressão de isoformas
- Faixas do navegador do genoma
- Relatório de projeto em formato PDF ou estilo HTML
Como Escolher a Estratégia de Descoberta de Isoformas e Splicing Correta
Uma estratégia forte começa com a questão da transcriptómica. Ajudamo-lo a decidir que camada de evidência e profundidade de análise são necessárias antes de avançar para a execução do projeto.
Escolha a leitura longa primeiro quando a estrutura da transcrição for central.
Uma estratégia de leitura longa-primeiro é frequentemente apropriada quando o seu projeto se concentra em modelos de transcritos de comprimento completo, isoformas novas, padrões de splicing complexos, revisão de transcritos de fusão ou refinamento de anotações.
Escolha suporte de leitura curta quando a profundidade da expressão for importante.
A sequenciação de RNA de leitura curta continua a ser útil quando o seu projeto necessita de um forte perfil de expressão a nível de grupo, ampla cobertura de amostras ou suporte à quantificação. Também pode apoiar análises híbridas quando leituras longas definem estruturas de transcritos e leituras curtas fortalecem a comparação de expressão.
Adicione análise de célula única ou análise espacial quando o contexto celular for importante.
Se a utilização de isoformas pode diferir consoante o tipo celular, o estado celular ou a região tecidual, a transcriptómica de célula única ou espacial pode adicionar contexto que os dados em massa podem perder.
Adicione bioinformática personalizada quando a interpretação é o verdadeiro desafio.
Um ficheiro de modelo de transcrição ou uma tabela de eventos de splicing podem não responder à sua questão de pesquisa por si só. A bioinformática personalizada pode ajudar a conectar isoformas e eventos de splicing a genes, vias, mecanismos candidatos, diferenças entre grupos ou resumos prontos para visualização.
Referências
- Avaliação abrangente dos métodos de deteção de isoformas de mRNA para dados de sequenciação de long-read
- Descoberta e quantificação precisas de transcritos de leitura longa a nível de célula única, pseudo-bulk e bulk com Isosceles.
- Sequenciação de leitura longa para 29 subtipos de células imunes revela isoformas ligadas a doenças
- Sequenciação direcionada de leitura longa a partir de células únicas revela variação transcricional no câncer de ovário
- Coordenação de splicing alternativo e poliadenilação alternativa revelada por sequenciação direcionada de longas leituras
Conformidade / Isenção de responsabilidade
A CD Genomics fornece este serviço apenas para Uso em Investigação (RUO). Este serviço não se destina a diagnóstico clínico, interpretação médica direta ou testes diretos ao consumidor.
Resultados da Demonstração
Os resultados da demonstração ajudam a sua equipa a compreender como podem ser os resultados finais da análise antes de iniciar o projeto. Estes exemplos mostram tipos de resultados, não conclusões biológicas fixas.
Vista da estrutura do isoforma de comprimento total
Esta saída mostra modelos de transcritos para isoformas conhecidas e novas do mesmo gene, incluindo a estrutura de éxons e íntrons, comprimento do transcrito, regiões codificantes, regiões não traduzidas e estado de anotação.
Visualização de eventos de splicing alternativo
Esta saída mostra padrões de eventos de splicing, como a omissão de exões, retenção de intrões, locais de splicing alternativos ou exões mutuamente exclusivos.
Uso diferencial de isoformas e visão de interpretação
Esta saída compara a utilização de transcritos entre grupos e liga padrões de isoformas a genes candidatos, vias ou anotações funcionais.
Perguntas Frequentes
1. O que é a descoberta de isoformas e a análise de splicing alternativo?
A descoberta de isoformas identifica estruturas de transcritos completos e variantes de transcritos novas. A análise de splicing alternativo deteta como os exões e intrões são incluídos, omitidos ou reorganizados entre as formas de transcritos. Juntas, ajudam a explicar a diversidade de transcritos para além da expressão a nível de gene.
2. Quando é que a sequenciação de RNA de leitura curta não é suficiente para a transcriptómica?
A sequenciação de RNA de leitura curta pode não ser suficiente quando a questão principal depende da estrutura do transcrito completo, novos isoformas, splicing complexo, mudança de transcrito ou interpretação ao nível de isoforma. Nesses casos, estratégias de leitura longa ou híbridas podem fornecer melhores evidências da estrutura do transcrito.
3. Qual é a diferença entre a descoberta de isoformas e a deteção de eventos de splicing alternativo?
A descoberta de isoformas reconstrói modelos de transcritos e identifica isoformas de transcritos conhecidas ou novas. A deteção de eventos de splicing alternativo foca em padrões de splicing específicos, como a omissão de exões, retenção de intrões ou locais de splicing alternativos.
4. Como diferem o sequenciamento de transcritos completos PacBio Iso-Seq e o sequenciamento de transcritos completos Nanopore?
O PacBio Iso-Seq é frequentemente utilizado para a descoberta de isoformas de cDNA de comprimento completo com alta confiança. O sequenciamento de transcritos de comprimento completo por Nanopore fornece evidências de transcritos de leitura longa e opções de fluxo de trabalho flexíveis. A melhor escolha depende da qualidade do RNA, do objetivo da pesquisa, do número de amostras, da complexidade do transcrito e das necessidades de análise posterior.
5. Quando devo considerar o Sequenciamento de RNA Direto por Nanopore?
A sequenciação de RNA direta por nanoporo pode ser útil quando a evidência de RNA nativo, sequenciação sem amplificação, questões relacionadas com o poli(A) ou análise de características de RNA são importantes para o projeto. Deve ser selecionada com base na qualidade da amostra e nos objetivos da pesquisa.
6. Esta solução pode funcionar para organismos não-modelo ou amostras de plantas e animais?
Sim. Muitos projetos de transcriptoma de organismos não modelo, plantas e animais podem beneficiar da descoberta de isoformas e do aprimoramento da anotação. O design do fluxo de trabalho depende da qualidade do RNA, do estado do genoma de referência, da completude da anotação e do tipo de amostra.
7. Que informações sobre a amostra de RNA são necessárias antes de recomendar um fluxo de trabalho?
Normalmente precisamos de espécies, tipo de amostra, método de extração, informações sobre a qualidade do RNA, número de amostras, grupos experimentais, estado do genoma de referência, dados de sequenciação existentes e a principal questão de investigação.
8. Que resultados posso esperar da análise de isoformas e splicing?
Os entregáveis podem incluir resumos de QC, resultados de reconstrução de transcritos, catálogos de isoformas de comprimento total, tabelas de novas isoformas, tabelas de eventos de splicing alternativo, matrizes de expressão de isoformas, resultados de uso diferencial de isoformas, arquivos de anotação, faixas de navegador do genoma e um relatório do projeto.
9. Podem os resultados de isoformas ser integrados com dados existentes de RNA-seq ou de células únicas?
Sim. Dados de RNA-seq existentes podem apoiar a quantificação e a comparação de grupos. Dados de célula única ou espaciais podem ajudar a interpretar o uso de isoformas específicas de tipo celular ou região tecidual quando o desenho do estudo suporta a integração.
10. Fornecem saídas prontas para visualização, como gráficos de sashimi ou faixas de navegador do genoma?
Sim. Podemos preparar diagramas de estrutura de isoformas, gráficos estilo sashimi, mapas de calor de utilização de transcritos, faixas de navegador do genoma e resumos prontos para figuras quando estas saídas estão incluídas no plano de análise.
11. Como devo escolher entre uma solução apenas de sequenciação e uma solução de descoberta completa?
Apenas o sequenciamento pode ser suficiente se a sua equipa já tiver um pipeline de análise a nível de transcritos validado. Uma solução de descoberta completa é mais útil quando precisa de ajuda com a seleção de plataformas, controlo de qualidade de RNA, reconstrução de transcritos, análise de splicing, quantificação de isoformas, anotação, visualização e relatórios prontos para interpretação.
Caso de Literatura: Avaliação Comparativa da Detecção de Isoformas de Longa Leitura para Descoberta de Transcritos
Destaque de Pesquisa Publicada
Diário: Comunicações da Natureza
Publicado: 2024
Fundo
A splicing alternativo cria isoformas de transcritos diversas, mas o RNA-seq de leitura curta nem sempre consegue reconstruir transcritos de comprimento completo ou resolver estruturas complexas de isoformas. O RNA-seq de leitura longa pode melhorar a descoberta da estrutura dos transcritos, mas o resultado final depende da plataforma de sequenciação, qualidade das leituras, anotação de referência e fluxo de trabalho computacional.
Métodos
O estudo avaliou 13 métodos de 9 ferramentas para a deteção de isoformas. Utilizou dados simulados de RNA-seq de leitura longa, sequências de RNA e conjuntos de dados experimentais. O benchmark incluiu condições de dados relacionadas com Nanopore e PacBio e avaliou fatores como profundidade de leitura, complexidade do transcriptoma, completude da leitura, taxa de erro de sequenciação, completude da anotação e utilização de recursos computacionais.
Resultados
- A Fig. 1 mostra o fluxo de trabalho geral de referência, incluindo conjuntos de dados simulados, conjuntos de dados experimentais públicos de RNA-seq de leitura longa de quatro espécies, dados de sequins, conjuntos de dados de hESC, deteção de isoformas, classificação, análise de uso diferencial de isoformas e avaliação de recursos computacionais.
- A Fig. 2 apresenta a precisão e a sensibilidade em configurações simuladas relacionadas ao Nanopore e ao PacBio.
- A figura compara como a profundidade de leitura, a complexidade do transcriptoma, a completude das leituras, a precisão das leituras e a completude da anotação afetam o desempenho na deteção de isoformas.
- O estudo apoia a necessidade de planear a descoberta de isoformas de leitura longa como um fluxo de trabalho de geração de dados e bioinformática, não apenas como uma corrida de sequenciação.
Um estudo de referência ilustra como a deteção de isoformas de leitura longa depende da geração de dados, da completude da anotação, da escolha do software e da análise subsequente do uso diferencial de isoformas.
Conclusão
Este caso de literatura apoia a lógica de decisão por trás da nossa Solução de Descoberta de Isoformas e Análise de Splicing Alternativo. A descoberta de isoformas não deve ser planeada apenas como uma corrida de sequenciação. Deve ser tratada como um fluxo de trabalho completo que conecta QC de RNA, estratégia de sequenciação, reconstrução de transcritos, análise de splicing alternativo, quantificação de isoformas, anotação, visualização e relatórios.
Publicações Relacionadas
As publicações seguintes apoiam a fundamentação científica para o sequenciamento de transcritos de leitura longa, descoberta de isoformas, análise de splicing alternativo e bioinformática a nível de transcritos.
Diário: Comunicações da Natureza
Ano: 2024
Diário: Comunicações da Natureza
Ano: 2024
Sequenciação de leitura longa para 29 subtipos de células imunes revela isoformas ligadas a doenças
Diário: Comunicações da Natureza
Ano: 2024
Diário: Comunicações da Natureza
Ano: 2024
Diário: Comunicações da Natureza
Ano: 2023
