Serviços de Sequenciação Oxford Nanopore — Leituras Ultra-Longas, Decisões em Tempo Real, RNA Direto
A única tecnologia de sequenciação que fornece leituras ultra-longas de classe Mb, transmite dados em tempo real e sequencia RNA nativo diretamente — sem transcrição reversa ou amplificação. A plataforma Oxford Nanopore da CD Genomics oferece as leituras mais longas em genómica, a capacidade de interromper uma corrida quando tem dados suficientes e acesso direto a modificações de RNA que outras plataformas não conseguem detetar.
O que oferecemos:
Leituras ultra-longas (classe Mb) para montagem de genoma sem lacunas e resolução de repetições complexas
Sequenciação direta de RNA — RNA nativo, sem transcrição reversa, sem viés de amplificação
Controlo de sequenciamento em tempo real — monitorize o rendimento ao vivo, pare quando os objetivos forem atingidos.
Apoio de projeto de ponta a ponta: preparação da biblioteca → sequenciação → bioinformática → relatórios prontos para publicação
Problemas que resolvemos:
Resolva telómeros, centrômeros e duplicações segmentares — regiões onde leituras curtas falham.
Sequenciar isoformas completas e detectar modificações de RNA diretamente a partir de moléculas de RNA nativas.
Monitorize o progresso da sequenciação em tempo real e termine as corridas assim que tiver dados suficientes.
Confiança: QC orientado por SOP · FASTQ mais FAST5/POD5 opcional · design de estudo consultivo
Quando Leituras Ultra-Longas e Tempo Real Importam
Se o seu projeto requer leituras superiores a 20 kb — para abranger grandes variantes estruturais, fechar lacunas no genoma ou resolver isoformas de transcritos de comprimento total — a Oxford Nanopore é a sua melhor opção. A Nanopore detém o recorde das leituras de sequenciamento mais longas já produzidas (excedendo 2 Mb). É também a única plataforma que transmite dados em tempo real — permitindo que você pare uma corrida assim que tiver cobertura suficiente — e a única plataforma que sequencia moléculas de RNA nativas diretamente, preservando informações de modificação que métodos baseados em cDNA perdem.
Claro, as leituras de nanoporo brutas trocam alguma precisão por leitura por estas capacidades (tipicamente Q10–20 brutas, melhorando com a mais recente química e os chamadores de base Dorado). Para projetos que exigem a mais alta precisão por leitura, considere o PacBio HiFi; para os maiores intervalos de leitura, monitorização em tempo real e análise direta de RNA, o Nanopore não tem igual.
Como Funciona a Sequenciação por Nanoporos
A sequenciação por nanoporo passa uma única molécula de DNA ou RNA através de um nanoporo proteico embutido em uma membrana eletricamente resistente. À medida que cada nucleótido transita pelo poro, ele perturba a corrente iónica de uma maneira específica à sequência. Essas alterações na corrente são registadas em tempo real e decodificadas em sequências de nucleótidos (A, T, C, G — ou bases de RNA) por um basecaller de rede neural como o Dorado.
Ao contrário da Illumina (sequenciação por síntese com amplificação em clusters) ou da PacBio (detecção óptica de nucleotídeos marcados fluorescentemente em guias de onda de modo zero com consenso circular), a Nanopore lê a molécula nativa diretamente. Não há amplificação, não há síntese e não há medição óptica envolvidas. O sinal bruto transporta não apenas a identidade da base, mas também informações sobre modificações (5mC, 6mA e modificações de RNA), que podem ser extraídas bioinformaticamente sem preparação adicional da amostra.
Por que é importante para a sua pesquisa:
Leituras ultra-longas (que excedem 1 Mb de forma rotineira, com leituras recorde que ultrapassam 2 Mb). Abrangem telómeros, centrómeros, duplicações segmentares e grandes variantes estruturais que não podem ser resolvidas com plataformas de leituras curtas ou de comprimento intermédio.
Streaming de dados em tempo real. Os resultados de sequenciação são gerados à medida que a molécula passa pelo poro, permitindo o monitoramento ao vivo do rendimento, amostragem adaptativa (enriquecer ou esgotar regiões-alvo em tempo real) e a terminação imediata da corrida quando dados suficientes são coletados.
Deteção direta de RNA e modificações nativas. Sequencie moléculas de RNA sem transcrição reversa ou viés de amplificação. Detete metilação de DNA (5mC, 6mA) a partir de leituras genómicas e modificações de RNA (m6A, pseudouridina, inosina) a partir de leituras diretas de RNA — tudo a partir do sinal bruto, sem necessidade de conversão com bisulfito ou etapas de enriquecimento.
Uma linhaSequenciação de tRNA de comprimento completo com deteção direta de modificações de RNA na plataforma Nanopore. Perfilagem completa de isoaceitadores e isoformas de tRNA com captura de modificações nativas, incluindo m1A, m3C, m7G, pseudouridina e outras marcas epitranscriptómicas.
Melhor parabiologia do tRNA, estudos sobre o panorama de modificações, caracterização de tsRNA, perfil epitranscriptómico.
Uma linhaResolva comunidades microbianas complexas com leituras longas de nanopore para classificação ao nível de espécies, genomas montados a partir de metagenomas (MAGs) e perfilagem de genes de resistência. Disponível nas plataformas PacBio HiFi e Oxford Nanopore.
Melhor paraComunidades metagenómicas complexas, metagenómica aplicável em campo, vigilância de patógenos em tempo real.
Sequenciação de cDNA de Comprimento Total com Nanoporos
Uma linhaSequenciar moléculas de cDNA de comprimento completo para a descoberta de transcritos a nível de isoforma. Reverta a transcrição do RNA em cDNA e, em seguida, sequencie diretamente — capturando estruturas de transcritos completas do extremo 5' ao extremo 3' sem montagem.
Melhor paraDescoberta de isoformas de transcritos de comprimento total, identificação de transcritos novos, quantificação da expressão de isoformas.
Sequenciação de Amplicões de 16S/18S/ITS de Comprimento Total por Nanopore
Uma linhaAmplificar e sequenciar regiões de genes rRNA de comprimento total (16S, 18S, ITS) com leituras longas de Nanopore para resolução taxonómica a nível de espécie e de estirpe que os amplicons de leituras curtas não conseguem alcançar.
Melhor para: Perfilagem da comunidade microbiana, análise do microbioma ambiental, classificação taxonómica a nível de estirpe.
O Que Você Receberá
Cada projeto da Oxford Nanopore é entregue com dados transparentes, documentação detalhada e métricas de controlo de qualidade reproduzíveis—garantindo confiança pronta para publicação.
Ficheiros de dados principais (para cada projeto)
FASTQ (.fastq.gz) — leituras com chamada de base (Dorado).
Sinal bruto opcional — FAST5/POD5 por solicitação para reanálise consciente de modificações.
Memorando do projeto — o protocolo de sequenciação por nanoporo utilizado (kit de biblioteca, célula de fluxo/química, configurações de execução), além das versões de software e parâmetros.
Relatório de execução e controlo de qualidade (por amostra e por código de barras)
Rendimento e taxa de produção: leituras/bases totais; contagens de aprovação/reprovação.
Métricas de comprimento de leitura: N50/N90, histogramas de comprimento.
Qualidade: distribuição do Q-score, resumos de precisão de leitura.
Desempenho de codificação: taxas de atribuição, equilíbrio entre amostras.
Se alinhado: taxa de mapeamento, uniformidade de cobertura/duplicados, resumos on-/off-target (para alvo/amplicon).
Se aplicável: utilização de poros ao longo do tempo e notas de execução para apoiar os registos do estudo.
Saídas de Análise Opcionais (Escolher por Serviço)
Aplicação
Entregáveis
Genomas (WGS Padrão / Ultra-Longo)
Assemblagem de novo (FASTA / GFA) com estatísticas (N50, NG50, BUSCO ou QC de k-mer se aplicável)
Conjuntos de variantes: SNV / indel / SV em formato VCF com instantâneas de evidências de suporte.
Haplótipos faseados opcionais mediante solicitação
Epigenética (Metilação do DNA)
Tabelas de chamadas de 5mC / 6mA por site (bedMethyl / TSV)
Sumários de regiões diferencialmente metiladas (DMR)
Relatórios de enriquecimento de motivos e análise de contexto
Localização do início da transcrição (TSS) / local de terminação (TES) e gráficos de distribuição da cauda poli(A) (para fluxos de trabalho TAIL)
Amplicon / Alvo (Cas9 ou Amostragem Adaptativa)
Resumo da validação de sequências de primers / guias
Sequências de consenso por amplicão
Ficheiro de chamadas de variantes (VCF) com estimativas de frequência alélica
Tabelas de resumo de cobertura em alvo / fora de alvo
Genoma 3D (Pore-C)
Matrizes de contacto processadas (.cool / .mcool / .hic)
Tabelas de resumo de Loop e TAD
Faixas de visualização do navegador do genoma (bigWig / bigBed)
Protocolo de Sequenciação por Nanoporos
Recepção e Controlo de QualidadeQubit quant; A260/280 ~1.8–2.0, A260/230 ≥2.0. gDNA HMW para Ultra-Long; RIN de RNA ≥8.
Preparação de biblioteca (por aplicação)Padrão WGS; Ultra-Longo (manuseio suave de HMW); Amplicon; Direcionado (Cas9 ou amostragem adaptativa); cDNA/lncRNA de comprimento total; RNA direto; Pore-C; TAIL Iso-Seq.
Célula de fluxo e códigos de barrasDimensionado para rendimentos/objetivos; equilibrar entradas com código de barras.
Sequenciação e controlo1–72 h típico; monitorização ao vivo; parar/estender ou recarregar conforme necessário; ativar amostragem adaptativa onde suportada.
Basecalling e demultiplexaçãoMinKNOW + Dorado → FASTQ; opcional FAST5/POD5 para reanálise consciente de modificações.
QC pós-corrida: rendimento/aprovado-reprovado; comprimento de leitura N50/N90; distribuição de pontuação Q; mapeamento/cobertura e alvo/não alvo (se alinhado).
Documentação e entrega: memorando de protocolo (kits/química/software), relatório de QC, resultados da análise delimitada; chamada de revisão opcional.
Bioinformática e Análise de Dados
O nosso serviço oferece tecnologia de sequenciação por nanoporo abrangente, bioinformática e suporte a aplicações para dados de leitura longa da Oxford Nanopore.
Bioinformática Padrão
Basecalling e demultiplexagem: Dorado/MinKNOW para produzir FASTQ por amostra.
Executar painéis de QC: rendimento, comprimento de leitura N50, distribuição de Q-score, equilíbrio de código de barras.
Leitura de preparação: recorte de adaptadores/primers, filtragem.
Alinhamento de referência (opcional): mapeamento ciente de leituras longas com resumos de cobertura; BAM/CRAM se solicitado.
Retenção de sinal (opcional): POD5/FAST5 preservado para reanálise consciente de modificações.
Análise Avançada
Montagem de Genoma De Novo — primeiro com leituras longas ou híbrido; montagens polidas com estatísticas de contiguidade.
Variação Estrutural (SV) e Chamadas de CNV — grandes indels, inversões, translocações; resumos de número de cópias.
Análise e Quantificação de Transcritos de Comprimento Total (Isoforma) — descoberta de isoformas, tabelas de expressão, deteção de fusões.
Análise de Modificação de DNA/RNA (Epigenética) — grau de investigação 5mC/6mA; resumos de sinais de modificação de RNA para RNA Direto.
Classificação Metagenómica — perfilagem taxonómica; suporte à montagem onde aplicável.
(Add-ons) Chamadas de Consenso e Variantes Alvo/Amplicon, Mapas de Contato Genómico 3D Pore-C.
Aplicações de Sequenciação por Nanoporos
Onde o sequenciamento Oxford Nanopore acrescenta mais valor na investigação:
Montagem e finalização de genomas de novo
Repetições de span e regiões complexas; resolver telómeros/centromeros.
Serviços recomendados: Sequenciação Ultra-Longa, Sequenciação de Leitura Longa Padrão WGS.
Variação estrutural (SV) e rearranjos complexos
Detetar grandes inserções/deleções, inversões, translocações, expansões de repetições.
Para coortes de variantes pequenas de alta profundidade, a leitura curta pode ser eficiente em termos de custo; designs híbridos (leitura curta + Nanopore) capturam tanto a profundidade como o contexto de longo alcance.
Nanopore vs PacBio HiFi vs Illumina — Comparação de Plataformas
Escolher a plataforma certa para o seu projeto? Aqui está como a Nanopore se compara à PacBio HiFi e à Illumina nas dimensões que importam para os resultados da pesquisa.
Dimensão
Nanopore (ONT)
PacBio HiFi
Illumina
Princípio
Corrente iónica através de um nanoporo proteico; chamada de base por rede neural
Deteção óptica em ZMWs; consenso circular (CCS)
Sequenciação por síntese; imagem de clusters
Comprimento de leitura (típico)
Rotina de 10–100 kb; ultra-longo até 2 Mb+
~15–20 kb leituras HiFi; subleituras até ~100 kb
Até 2×300 pb
Precisão de pré-leitura (bruta)
Q10–Q20 bruto; a melhorar com R10.4.1 + Dorado; alta precisão com profundidade de consenso
QV ≥30 (≥99,9%) via consenso CCS
≥99,9% bruto
Tempos de dados
Transmissão em tempo real; parar ou estender uma corrida ao vivo
Lote (análise após a conclusão da execução)
Lote
Biologia nativa
Sequenciação direta de RNA; 5mC/6mA a partir de sinal bruto; modificações de RNA sem RT ou amplificação.
5mC da cinética da polimerase; não é necessário bisulfito.
Deteção de modificação não nativa (fluxos de trabalho padrão)
Onde brilha
Ultra-longo alcance (telómeros, SVs massivos, fecho de lacunas); trabalho em tempo real/campo; RNA direto
Maior precisão em leituras longas; montagens e metilação a partir de um único conjunto de dados.
Cohortes de SNV/indel profundas; estudos grandes e custo-eficientes
Compromissos
Precisão bruta inferior à HiFi ou Illumina; bioinformática sensível ao sinal necessária.
Tempos de execução mais longos; sem controlo em tempo real ou streaming
Sem contexto de longo alcance; não é possível detectar modificações nativas.
Guia de decisão rápida:
Necessita de leituras superiores a 100 kb ou sequenciação de campo → Nanopore.
Necessita da mais alta precisão em leituras longas para montagens e chamada de variantes → PacBio HiFi.
Precisa de sequenciação de RNA direta ou dados em tempo real → Nanopore é a única opção.
Cohortes grandes de SNV/indel com orçamento limitado → Illumina para profundidade; adicionar leituras longas de Nanopore para SVs e faseamento.
Designs híbridos: Nanopore ultra-longo + PacBio HiFi para montagens completas T2T; leituras longas Nanopore + leituras curtas Illumina para deteção de SV com validação profunda de SNV.
O desempenho real varia com a qualidade da amostra, preparação da biblioteca, profundidade de sequenciação e pipeline de análise.
Qualidade e Design do Estudo
Replicados e ControloRecomendar ≥2 réplicas biológicas por condição; incluir negativos para amplicão/dirigido; spike-ins opcionais para metilação.
Planeamento de Cobertura: Dimensionar a profundidade de leitura longa em relação à complexidade do genoma/objetivos de SV; planear a profundidade em alvo para direcionado/amplicon; dimensionar leituras/amostra para isoformas ou RNA Direto.
Critérios de AceitaçãoMetas pré-acordadas para rendimento por código de barras, fração dentro do alvo, taxa de mapeamento e perfil de comprimento de leitura (por exemplo, metas N50 para Ultra-Long).
Decisões em Tempo de ExecuçãoUtilize painéis em tempo real para parar/extender/recarregar de forma eficiente; documente quaisquer variações no memorando do projeto.
A Vantagem da CD Genomics
1
Escopo orientado a aplicações
Mapeie a sua questão biológica ao serviço certo da Oxford Nanopore (Ultra-Long, Direct RNA, Full-Length Transcript/lncRNA, Targeted/Cas9 ou adaptativo, Amplicon, Pore-C, TAIL Iso-Seq).
2
Modelagem de design e viabilidade
Modelagem de cobertura, equilíbrio de código de barras e verificações de viabilidade de alvo/primer antes de se comprometer.
3
Análise reproduzível
Pipelines encapsulados/bloqueados por versão; embalagem de resultados limpa com relatório de análise e dicionário de dados.
4
Eficiência de corrida em tempo real
Painéis ao vivo para parar/estender/recarregar quando os objetivos são alcançados; amostragem adaptativa quando apropriado.
5
Integridade e segurança dos dados
Pastas estruturadas, verificação de checksum e transferência segura com uma política de retenção definida.
6
Apoio de qualidade para publicação
Orientação opcional sobre resultados, preparação de figuras/tabelas e assistência na redação/revisão de manuscritos.
7
Neutralidade entre plataformas
Orientação objetiva sobre quando estratégias híbridas (short-read + ONT, ou HiFi + ONT) acrescentam valor.
Requisitos de Amostra
Serviço
Quantidade e Integridade
Pureza
Armazenamento / Envio
Notas Principais
WGS (Padrão)
≥1–3 μg gDNA, ≥30 kb
A260/280 1,8–2,0; A260/230 ≥2,0
−20°C em gelo
Fornecer método de extração; sem vortexação.
WGS Ultra-Long
≥3–5 μg de gDNA HMW, ≥50 kb preferido
A260/280 1.8–2.0; A260/230 ≥2.0
−20°C
Manuseio suave é crítico; apenas pontas de grande diâmetro.
Sequenciação de RNA Direta
≥500 ng–1 μg de RNA poli(A)+; RIN ≥7
A260/280 ~2,0; A260/230 ≥2,0
gelo seco a -80°C
Não aqueça nem desnature antes do envio.
Transcrição Completa
≥500 ng–1 μg de RNA total; RIN ≥8
A260/280 ~2.0; A260/230 ≥2.0
gelo seco a -80°C
Poly(A)+ ou rRNA-depletado por design
LncRNA de Comprimento Total
≥500 ng–1 μg de RNA total; RIN ≥7
O mesmo que acima
gelo seco a -80°C
depleção de rRNA ou seleção de poli(A)
Sequenciação de Amplicons
≥50–200 ng amplicões agrupados
PCR limpo; sem dímeros de primers
pacote frio a 4°C
Fornecer tabela de primers e gene alvo.
Dirigido (Cas9/Adaptativo)
≥1–3 μg gDNA
A260/280 1,8–2,0
−20°C
Forneça um ficheiro BED da região-alvo ou uma lista de genes.
Pore-C
≥1–2 μg gDNA HMW, ≥50 kb
A260/280 1,8–2,0
−20°C
Manuseio suave; sem vortexação
TAIL Iso-Seq
≥500 ng–1 μg de RNA total; RIN ≥7
A260/280 ~2,0
gelo seco a -80°C
Seleção de Poly(A)+ necessária
Sequenciação de tRNA Nano
≥500 ng de RNA total; RIN ≥7
A260/280 ~2,0; A260/230 ≥2,0
gelo seco a -80°C
Fornecer método de enriquecimento de tRNA se auto-enriquecido.
Long Reads Amplicon
≥100 ng amplicons agrupados; ≥500 bp alvo
PCR limpo; sem dimers de primers
pacote frio a 4°C
Fornecer tabela de primers + coordenadas alvo
Notas gerais
Evite inibidores (fenol, heparina, EDTA, polissacarídeos) e ciclos repetidos de congelamento e descongelamento; não seque excessivamente as esferas.
Utilize pontas de grande diâmetro e não faça vortex para DNA de alto peso molecular.
Incluir um breve método de extração e quaisquer contaminantes conhecidos.
Matrizes de baixo input/FFPE ou incomuns podem ser viáveis—contacte-nos para um protocolo personalizado.
Autores: Bin Sun, Kaushal Kumar Bhati, Peizhe Song, et al.
Data de publicação: 27 de setembro de 2022
Revista: PLOS Genetics
Questão de pesquisa (Atenção):
Qual enzima instala m^6A no 3′UTR do mRNA do FLOWERING LOCUS C (FLC) e como essa modificação afeta a estabilidade do transcrito FLC e a floração?
Abordagem:
Um design multi-óptico integrou a sequenciação de RNA Direct Oxford Nanopore, mRNA-seq e meRIP-seq para perfilar a expressão diferencial e a metilação diferencial de RNA em plantas do tipo selvagem vs mutantes FIONA1 (FIO1). O RNA Direct capturou características de sinal nativo, enquanto o meRIP-seq mapeou regiões enriquecidas em m^6A; as evidências combinadas apontaram o local da modificação na 3′UTR do FLC.
Principais conclusões:
FIO1 é a metiltransferase responsável pela m^6A no 3′UTR do mRNA FLC.
A perda desta metilação na extremidade 3′ em mutantes fio1 desestabiliza o mRNA do FLC (níveis reduzidos de FLC) e contribui para um fenótipo de floração precoce.
Os autores divulgaram dados de RNA direto de Nanopore (GEO: GSE212766) e conjuntos de dados correspondentes de mRNA/meRIP, apoiando a reprodutibilidade.
Análise de sequenciação de RNA direta.
O que isto demonstra:
Este estudo revisto por pares demonstra como a sequenciação de RNA direta por nanopore—em conjunto com a análise de modificações de RNA (m^6A)—responde a questões biológicas que dependem de RNA nativo e regulação pós-transcricional. É um forte exemplo de "tecnologia de sequenciação por nanopore, bioinformática e aplicações" para epitranscriptómica e mecanismos de regulação genética.
Como a CD Genomics abordaria um projeto semelhante.:
ServiçoSequenciação de RNA Direto por Nanopore (+ meRIP-seq opcional através de fluxo de trabalho parceiro)
Análiseperfilamento de isoformas, resumos de sinais associados a modificações, expressão diferencial, integração com picos de m^6A baseados em imunoprecipitação
EntregáveisFASTQ (RNA Direto), POD5/FAST5 opcional, relatório de QC, resumos de modificações, figuras/tabelas adequadas para publicação.
Perguntas Frequentes — Sequenciação Nanopore
Apenas para fins de investigação, não se destina a diagnóstico clínico, tratamento ou avaliações de saúde individuais.
Publicações
FIONA1-mediated methylation of the 3’UTR of FLC affects FLC transcript levels and flowering in Arabidopsis
Diretrizes para Submissão de Amostras
Análise de sequenciação de RNA direta.
