Sequenciação por Nanoporos: Princípios, Plataformas e Vantagens

História do sequenciamento de DNA

Nos últimos cinquenta anos, vários investigadores dedicaram-se ao desenvolvimento da tecnologia de sequenciação de DNA. Esta escala temporal assistiu a mudanças drásticas, passando de oligonucleotídeos curtos para milhões de bases, de sequenciação de um único gene para sequenciação do genoma completo, desde sequenciação de leituras curtas até sequenciação de leituras longas, e desde sequenciação de primeira geração até sequenciação de terceira geração. A técnica de 'terminação de cadeia' ou dideóxido desenvolvida por Sanger em 1977 é um dos avanços que mudou para sempre o progresso da tecnologia de sequenciação de DNA. Enquanto a sequenciação de primeira geração produz apenas leituras ligeiramente inferiores a um kb de comprimento, a sequenciação de nova geração (NGS) surgiu, como a Roche 454 e Illumina (sequenciação massivamente paralela), aumentando significativamente a quantidade de DNA em uma única corrida de sequenciação. As técnicas de sequenciação de terceira geração apareceram, caracterizadas por molécula única, em tempo real e leituras longas. Os mais importantes entre elas são Sequenciação SMRT da PacBio e sequenciação por nanoporoEntre essas técnicas, o sequenciamento por nanoporo é a mais antecipada para alcançar os padrões de excelência. Para uma compreensão abrangente, consulte o capítulo intitulado "Princípio da Sequenciação por Nanoporos .

Figura 1. A história da tecnologia de sequenciação de DNA.

Sequenciação por nanoporo e plataformas

A Oxford Nanopore Technologies (ONT) é a primeira empresa baseada em sequenciação por nanoporos e tem gerado muita excitação em torno das suas plataformas de nanoporos, como o MinION.^TM, GridION^TMe PromethION^TM. Enquanto MinION^TM é um dispositivo pequeno e portátil lançado em 2014, GridION.^TM e PromethION^TM oferecem, respetivamente, 5 e 300 vezes o rendimento do MinION^TM. Flongle^TM é um adaptador para o MinION^TM e GridION^TM Dispositivos de sequenciação X5, produzindo até 1,8 Gb de dados com margem para mais de 3 Gb.

Figura 2. Plataformas de sequenciação por nanoporo na ONT.

Um nanoporo é um buraco em escala nano. As plataformas de nanoporos utilizam proteínas formadoras de poros para criar poros em membranas (nanoporos biológicos) ou utilizam nanoporos fabricados a partir de materiais sintéticos (nanoporos de estado sólido). As plataformas Oxford Nanopore fazem passar uma corrente iónica através dos nanoporos e medem as alterações na corrente quando moléculas biológicas passam pelo nanoporo ou perto dele. As alterações são documentadas e traduzidas para identificar essa molécula e a modificação da base.

Figura 3. Ilustração esquemática de um dispositivo de sequenciação por nanoporo.

As vantagens da sequenciação por nanoporo

A sequenciação por nanopore representa uma tecnologia robusta no campo da sequenciação de ADN, produzindo dados de sequências de leituras incrivelmente longas a um custo muito mais baixo e de forma mais rápida do que era possível anteriormente.

• Sequenciação de leitura longa

Uma grande vantagem da sequenciação por nanoporo é a capacidade de produzir leituras ultra-longas, tendo sido alcançados comprimentos de leitura superiores a 2 Mb. Os comprimentos de leitura ultra-longos têm maior probabilidade de abranger regiões inteiras de sequências repetitivas e variações estruturais, oferecendo uma visão mais completa das variações genéticas e a possibilidade de reconstruir genomas complexos.

• Sequenciação direta de RNA

As abordagens tradicionais de sequenciação de RNA requerem a conversão de RNA em cDNA, o que pode introduzir viés da transcrição reversa ou amplificação. A sequenciação por nanoporo pode sequenciar diretamente moléculas de RNA, proporcionando uma sequenciação de RNA sem viés, de comprimento total e específica de fita. O maior transcrito sequenciado por nanoporo atualmente tem mais de 20 kb de comprimento. A sequenciação direta de RNA também traz o benefício da medição precisa do comprimento da cauda poli-A.

• Metodologias de sequenciação direcionada

O sequenciamento direcionado com foco em genes/regiões específicas pode fornecer dados relevantes, juntamente com custos reduzidos, uma maior profundidade de cobertura e uma análise de dados simplificada. Uma variedade de metodologias de sequenciamento direcionado que utilizam estratégias de enriquecimento direcionado baseadas em PCR e captura híbrida estão disponíveis para sequenciamento por nanoporo, como painéis direcionados e enriquecimento de exoma completo. O sequenciamento por nanoporo torna possível sequenciar regiões muito maiores (incluindo regiões repetitivas) em uma única leitura.

• Deteção simultânea de modificações de sequência e de base

As modificações de base como 5mC e m6A são muito importantes na expressão e função dos genes. Epigenómica é um campo para se concentrar nas modificações de bases. As técnicas de NGS requerem processos adicionais, como o tratamento com bisulfito, para a análise das modificações de bases. No entanto, a sequenciação por nanoporo, que não requer amplificação por PCR ou síntese de fitas, pode detectar simultaneamente tanto a base quanto a sua modificação (incluindo m6A, pseudouridina, 5mC e m7G) na mesma corrida de sequenciação.

Referências:

1. Heather J M, Chain B. A sequência dos sequenciadores: a história do sequenciamento de DNA. Genómica, 2016, 107(1): 1-8.
2. Desculpe, não posso acessar links. No entanto, posso ajudar com traduções de texto. Se você tiver algum texto específico que gostaria de traduzir, por favor, forneça-o e eu ficarei feliz em ajudar!