Aplicação da tecnologia de sequenciação por nanoporo

Sequenciação por nanoporo a tecnologia possui várias vantagens proeminentes, incluindo, de forma geral, longas extensões de leitura, alta produção, portabilidade, operação em tempo real, facilidade de uso e capacidades de leitura direta. Uma explicação mais detalhada dessas vantagens pode ser encontrada no artigo "Por Que Escolher o Sequenciamento por Nanoporos?". Essas características tornam esta tecnologia imensamente valiosa no âmbito da genómica ou análises transcriptómicasEste documento tem como objetivo fornecer uma lista de casos de uso típicos de Sequenciação por nanoporo tecnologia em aplicações reais como referências para os leitores.

Sequenciação por nanoporo encontra aplicações em diversos domínios de pesquisa: montagem de genomas (por exemplo, nível de Mb) sequenciação de leitura longa), deteção direta de modificações de bases (por exemplo, sequenciação de DNA/RNA), sequenciação direcionada a nível de cromossoma e sequenciação em tempo real rápida de metagenomas (deteção de microrganismos patogénicos).

Grande Montagem do Genoma

Uma das características mais distintivas da tecnologia de sequenciação por nanopore é a sua capacidade de sequenciação de leitura longa, uma vantagem crucial na montagem de genomas grandes. No passado, a montagem de genomas baseada em fragmentos curtos apresentava desafios significativos, especialmente para organismos com características como poliploidia, repetições extensas e alta heterozigosidade. Para certas plantas como Paris japonica, com um tamanho de genoma de 152 Gb, e o decaploide Fragaria turupensis, a montagem por leituras curtas era inadequada. Apesar da introdução de técnicas como bibliotecas de grandes inserções, bibliotecas BAC, mapeamento óptico, Hi-C e bionano, os desafios fundamentais da montagem de grandes genomas persistiram. No entanto, o sequenciamento por nanoporo prova ser instrumental na resolução desses desafios e melhora significativamente a completude do genoma.

Identificação Rápida Microbiana

Graças às características em tempo real, rápidas e compactas da tecnologia de sequenciação por nanoporo, é possível realizar a sequenciação direta, facilitando a aquisição imediata de informações de sequência para a classificação e identificação de espécies, permitindo assim um reconhecimento microbiano rápido. Com o aumento da capacidade de sequenciação, o monitoramento em tempo real tem sido amplamente aplicado a patógenos com genomas maiores, desde vírus de apenas alguns quilobases (Kb), passando por bactérias com alguns megabases (Mb), até patógenos fúngicos humanos com genomas superiores a 10 Mb, todos os quais podem ser monitorizados no local e em tempo real.

O processo e a representação esquemática do sequenciamento de nanopore do rDNA 16S. O tempo de resposta foi de aproximadamente 6 a 8 horas desde a coleta da amostra até os resultados. (Yinghu Chen et al., 2023)

Deteção de Resistência Antimicrobiana em Microorganismos Patogénicos

A emergência da resistência a antibióticos através de mutações genéticas em patógenos representa um desafio significativo para o tratamento clínico. Atualmente, o Teste de Suscetibilidade a Antimicrobianos (AST) é o método principal para diagnosticar a resistência a medicamentos microbianos. No entanto, os métodos padrão de AST têm limitações. Sequenciação por nanoporo A tecnologia destaca-se na deteção de mutações em genes de resistência a medicamentos-alvo, oferecendo orientação em tempo real para o tratamento clínico e servindo como referência para a avaliação do prognóstico do paciente. A plataforma de sequenciação de alto rendimento, alta produção e eficiente proporciona um valor clínico crucial para alcançar a monitorização em tempo real.

Análise do Transcriptoma Completo

Historicamente, a análise do transcriptoma envolvia o sequenciamento de mRNA após fragmentação e transcrição reversa para cDNA. Neste processo, a PCR pode introduzir viés de amplificação, levando à identificação de genes diferencialmente expressos falsos positivos. Apesar do uso atual de métodos de célula única com códigos de barras moleculares para reduzir o viés da PCR, a obtenção e análise transcrições completas continua a ser um desafio. Devido às variações de emenda prevalentes em eucariotos, o sequenciamento de leituras curtas ainda enfrenta dificuldades na identificação precisa. No entanto, a utilização do sequenciamento de leituras longas por nanoporo permite a identificação precisa de múltiplos isoformas para cada gene, oferecendo uma abordagem simplificada e precisa.

Saiba mais: Sequenciação de Transcritos de Comprimento Completo: Uma Comparação Entre PacBio Iso-Seq e Nanopore Direct RNA-Seq

Sequenciação de RNA Direta

A tecnologia de sequenciação por nanoporo destaca-se como o único método capaz de sequenciar diretamente cadeias de RNA sem a necessidade de transcrição reversa e amplificação. Esta abordagem não apresenta preferência de sequenciação e deteta com precisão locais de metilação em moléculas de RNA, como as modificações m6A e m5C. Além disso, a sequenciação por nanoporo fornece uma estimativa relativamente precisa dos comprimentos das caudas de Poly(A), contribuindo para a revelação de características autênticas do RNA.

Deteção direta de modificações e estrutura de RNA utilizando sequenciação por nanoporo de molécula única. (William Stephenson) et al., Genómica Celular 2022)

Grandes Variações Estruturais

As variações genómicas englobam Variantes de Nucleótido Único (SNVs), Inserções e Deleções (Indels) e Variantes Estruturais (SVs). Sequenciamento do Exoma Completo (WES)A sequenciação de leitura curta, baseada em sequenciação de leitura curta, enfrenta limitações na deteção de variações estruturais, com uma taxa de deteção abaixo de 50%. Isto deve-se à instabilidade da sequenciação de leitura curta na identificação de regiões repetitivas e à sua dificuldade em cobrir áreas com alto conteúdo de GC. No entanto, pesquisas atuais confirmam a importância de caracterizar estas regiões repetitivas e variações estruturais em relação à saúde humana e condições de doença, como envelhecimento, distúrbios de repetição de trinucleotídeos, autismo, epilepsia e câncer. Portanto, a identificação e caracterização rotineira destas variações têm uma importância primordial. A tecnologia de sequenciação por nanoporo, com as suas vantagens de leituras ultra-longas (atualmente até 2,4 MB), ausência de viés de GC e deteção direta de metilação, supera os desafios enfrentados pela sequenciação de leitura curta na identificação de SVs genéticos, abrangendo sequências repetitivas.

Análise de Haplótipos de Mutação

A análise de haplótipos, também conhecida como faseamento, aborda fundamentalmente a informação de alelos em genomas diploides ou poliploides, distinguindo as suas origens parentais. Isso garante que a informação do mesmo progenitor esteja organizada de forma ordenada nos respectivos cromossomas. Claramente, o aumento no comprimento de sequenciamento tem implicações positivas para a análise de haplótipos (especialmente ao lidar com cromossomas completos, permitindo um alinhamento direto). De acordo com a literatura, a aplicação de leituras ultra-longas não só duplica a continuidade das montagens (NG50 ~ 6,4 MB), mas também melhora significativamente a eficácia do faseamento de genes alélicos. Por exemplo, alcançar o haplotipagem dentro de um único contig de 16 MB, especialmente para o Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) de 4 MB, torna-se uma perspetiva viável.

Montagem do Genoma Bacteriano

Dada a dimensão relativamente compacta dos genomas bacterianos, que normalmente não excedem 10 Mb, e a sua estrutura predominantemente de um único cromossoma com sequências repetitivas mínimas, a capacidade de leitura longa da tecnologia de nanopore permite a montagem de genomas inteiros em um único passo em poucos minutos (dependendo da amostra específica e das configurações de hardware).

As leituras de sequenciação por nanopore melhoram a montagem e a anotação de genes do Parochlus steinenii genoma (Shin, S.C. et al., 2019)

Conclusão

Enquanto as plataformas de sequenciação de leitura longa, representadas por Sequenciação por nanoporo a tecnologia, pode apresentar menor precisão em comparação com plataformas de segunda geração, a sua emergência como uma nova tecnologia, a diversidade de reagentes e a falta de métodos de análise padronizados contribuem para isso. No entanto, estas plataformas demonstram um desempenho louvável na identificação microbiana, deteção de patógenos, investigação oncológica e deteção de doenças genéticas. Apesar das suas limitações atuais, existe um potencial significativo para avanço, oferecendo novas perspetivas e técnicas para disciplinas científicas relevantes. Sequenciação por nanoporo está prestes a revelar um maior valor de pesquisa em várias áreas.

Referências:

1. Shin, S.C., Kim, H., Lee, J. et al.As leituras de sequenciação por nanopore melhoram a montagem e a anotação de genes do Parochlus steinenii genoma. Sci Rep nove, 5095 (2019).
2. Yinghu Chen et al., A melhoria do direcionamento do método de sequenciação por nanopore do 16S rDNA permite a identificação rápida de patógenos na pneumonia bacteriana em crianças. Front. Cell. Infect. Microbiol09 de janeiro de 2023
3. William Stephenson. et al.Deteção direta de modificações e estrutura de RNA utilizando sequenciação de nanoporo de molécula única. Genómica Celular 2022