Princípio da Sequenciação por Nanoporos

Introdução ao Sequenciamento por Nanoporos

A essência do sequenciamento de DNA reside na identificação dos quatro nucleotídeos: adenina (A), timina (T), citosina (C) e guanina (G). No entanto, o processo de reconhecimento é desafiador por duas razões principais. Primeiro, essas bases são incrivelmente pequenas, existindo na escala do nanómetro. Segundo, as estruturas químicas dos pares de bases purinas e dos pares de bases pirimidinas são notavelmente semelhantes, complicando sua diferenciação. Desde a proposição da estrutura da dupla hélice de DNA em 1953, os biólogos têm buscado incansavelmente várias metodologias para a identificação dessas quatro bases.

As metodologias de sequenciamento predominantes atualmente incluem a transdução da presença das quatro bases em sinais como luz, mudanças nos níveis de pH da solução ou sinais elétricos. As bases distintas são discernidas com base nas diferenças em seus sinais amplificados. Essas estratégias constituem a espinha dorsal dos equipamentos de sequenciamento convencionais atuais. Notavelmente, plataformas como Sanger, Illumina, BGIseq e Pacbio optaram por sinais de luz. Por outro lado, Ion Torrent utiliza variações no pH da solução, enquanto o Nanopore favorece sinais elétricos. O processo de sequenciamento não apenas depende de tecnologias de ponta, mas também sublinha o aspecto inovador que é semelhante a uma forma de arte.

O paradigma da tecnologia de Sequenciamento por Nanoporos remonta às suas fases iniciais na década de 1990, e sua evolução repousa sobre três saltos tecnológicos fundamentais. Inicialmente, a transmissão de moléculas de DNA únicas através de um nanoporo foi alcançada; um feito seguido pela adoção de um processo enzimático no nanoporo para supervisão do sequenciamento com resolução de um único nucleotídeo. Por fim, a precisão do sequenciamento de um único nucleotídeo tornou-se uma realidade. Esses avanços inovadores fortaleceram coletivamente o progresso da tecnologia de Sequenciamento por Nanoporos.

Princípio do Sequenciamento por Nanoporos

O Sequenciamento por Nanoporos opera com o princípio de imergir uma membrana polimérica sintetizada artificialmente em uma solução iônica. Esta membrana polimérica é pontuada com estruturas de proteínas de canal transmembrana modificadas, também conhecidas como proteínas de nanoporo ou proteínas "Leitor". Estas proteínas são integrais para a operação do sequenciamento por nanoporos. Dada a atividade biológica da proteína Leitor, o chip deve ser armazenado em um refrigerador a uma temperatura entre 4-8°C e posicionado longe das paredes do refrigerador para evitar congelamento devido a temperaturas locais mais baixas.

Sequenciamento direto de DNA ONT Shangqian (Xie et al., 2021)

A estrutura da membrana artificial embutida com proteínas possui propriedades insolúveis. Assim, quando um campo elétrico externo é aplicado, a corrente elétrica é transmitida exclusivamente através dos nanoporos. Diferentes tensões aplicadas em cada lado da membrana criam um diferencial de tensão, levando ao desenrolar e translocação do DNA sob a influência da proteína motora, através do nanoporo. Neste ponto, nucleotídeos individuais induzirão mudanças específicas na corrente iônica. Esta membrana exibe características de alta resistência elétrica. Ao aplicar um potencial à membrana imersa em uma solução eletroquímica, uma corrente iônica pode ser gerada no local do nanoporo.

A corrente elétrica passa pelo nanoporo. (Crédito: Oxford Nanopore Technologies)

Sequenciamento direto de DNA ONT (Shangqian Xie et al., 2021)

Uma vez que as moléculas de ácido nucleico exibem um alto grau de aleatoriedade enquanto passam por um fluxo de corrente controlado direcionalmente em seu estado não tratado, isso não é propício ao sequenciamento. Portanto, como outros métodos de sequenciamento de alto rendimento, o sequenciamento por nanoporos também requer a construção de bibliotecas.

Duas fitas do adaptador da biblioteca são conectadas separadamente à proteína motora e a um adaptador em Y. O adaptador em Y interage com o braço conector na membrana, auxiliando na posicionamento da biblioteca no nanoporo. A proteína motora no adaptador, em interação direta com a proteína do nanoporo, auxilia no posicionamento da biblioteca durante o sequenciamento. Ela facilita o desenrolar do ácido nucleico e regula a taxa de translocação através do poro.

Resumo

É evidente que o sinal inicial coletado pelos nanoporos é um sinal elétrico. Uma vez que o sinal está relacionado ao tamanho molecular no poro do canal, várias informações de modificação sobre o ácido nucleico permanecem preservadas dentro do sinal elétrico. Por fim, o sequenciador armazena o sinal elétrico na forma de arquivos 'fast5'. Após o processo de identificação da base, os arquivos 'fast5' são convertidos em arquivos 'fastq', que contêm a sequência de bases ATCG.

As bases de nanoporos são lidas em unidades de cinco bases por sinal elétrico, o que difere dos métodos de síntese durante o sequenciamento. Portanto, estritamente falando, os valores Q, usados para a avaliação da qualidade do sequenciamento de segunda geração, são inaplicáveis ao sequenciamento por nanoporos. A definição do valor Q é a probabilidade de ocorrer um erro para cada base medida. Portanto, avaliar o sequenciamento por nanoporos usando um único valor de qualidade de base é inadequado. O sequenciamento por nanoporos emprega seu próprio conjunto único de padrões de controle de qualidade, referidos como precisão de consenso.

Vale a pena notar que a precisão dos nanoporos está continuamente melhorando. A partir de 2023, o novo reagente Q20 garante que a precisão média do sequenciamento ultrapasse 99%. Da mesma forma, o sequenciamento de alto rendimento não é um padrão absoluto. Ele determina, em última análise, a base em um determinado locus avaliando a profundidade de sequenciamento naquele locus.

Para uma compreensão mais aprofundada do Sequenciamento por Nanoporos, considere consultar os seguintes artigos: "Por que Escolher o Sequenciamento por Nanoporos", "Sequenciamento por Nanoporos para Detecção de Variação Estrutural, Tipagem HLA e Análise de STR", "Aplicação da tecnologia de sequenciamento por nanoporos", "Sequenciamento por Nanoporos: Princípios, Plataformas e Vantagens", e "Sequenciamento de Transcritos de Comprimento Total: Uma Comparação Entre PacBio Iso-Seq e Nanopore Direct RNA-Seq".