Which readout should I choose first?

Start with the question you need to answer. If you need tissue-level presence, start with biodistribution. If you need sequence support, add targeted or vector sequencing. If you need expression evidence, add RNA-level analysis. If insertion-related events matter, integration-site analysis may be useful.

Can tissue, blood, DNA, and RNA samples be included in one project?

Yes, but they may require different handling, QC checks, and sequencing workflows. We review the sample types first, then align each sample group with the correct readout.

When is sequencing more useful than qPCR or ddPCR alone?

Sequencing is useful when copy-related detection is not enough. It can add target-region support, vector sequence information, expression profiling, integration-related evidence, or broader genomic context.

Can you help with AAV genome confirmation?

Yes. For AAV-related work, we can help assess whether AAV genome sequencing or target-region sequencing fits the project. The best option depends on the vector design, sample type, and question being asked.

When should integration-site analysis be considered?

Consider it when the delivery system can integrate, when insertion-related questions are part of the study, or when genomic location information is needed. It is not necessary for every biodistribution project.

What information should I send before requesting a project plan?

Useful information includes vector type, species, tissue list, timepoints, sample format, target sequence, construct map, desired readouts, and any existing DNA or RNA QC data.

What bioinformatics outputs can be included?

Depending on the project, outputs may include QC summaries, tissue-level tables, target-region read support, expression matrices, candidate insertion tables, visualizations, and report notes.

Can this solution support multi-tissue, multi-timepoint designs?

Yes. Multi-tissue and multi-timepoint designs are often a good fit for this solution when sample quality, grouping, and readout goals are planned before sequencing begins.

Análise de Sequenciação e Biodistribuição de Terapia Génica In Vivo

Índice

Workflow overview for in vivo gene therapy sequencing and biodistribution analysis

Conecte o desenho do estudo, amostras de tecido, resultados de sequenciamento, revisão de QC e saídas de análise num único plano de projeto.

Transformar Questões de Entrega In Vivo em Evidência Suportada por Sequenciamento

Os estudos de terapia génica in vivo frequentemente começam com uma pergunta direta: onde foi parar o material genético entregue? Uma vez que o projeto inclua múltiplos tecidos, grupos ou pontos temporais, essa questão torna-se mais complexa.

Pode ser necessário saber se um vetor é detetável em tecidos-alvo, se tecidos não-alvo mostram sinal, se a sequência pretendida é suportada por leituras, se a expressão ao nível do RNA está presente ou se a análise relacionada com a integração deve ser considerada para o seu sistema de vetor.

Ajudamo-lo a transformar essas questões num plano de sequenciação e biodistribuição que se adapte ao estudo, em vez de forçar cada projeto a encaixar-se no mesmo ensaio.

O que esta solução o ajuda a responder.

O vetor ou material genético entregue é detetado em tecidos selecionados?
Como é que os tecidos-alvo e não-alvo se comparam entre os grupos?
O genoma vetorial ou a região-alvo são suportados por leituras de sequenciamento?
O transgene apresenta expressão a nível de RNA em tecidos selecionados?
Deve ser adicionada a avaliação do local de integração ou do evento de inserção?
Quais saídas de QC e bioinformática são necessárias para a revisão interna?

O objetivo é escolher as leituras corretas antes de os amostras serem processadas, para que o pacote de dados final responda à pergunta que realmente precisa ser feita.

Sequencing-supported evidence map for in vivo gene therapy biodistribution studies

Uma leitura de biodistribuição a nível de tecido pode mostrar se uma sequência-alvo é detectável. Pode não confirmar a sequência do vetor mais ampla, explicar a expressão a nível de RNA ou abordar questões relacionadas com a integração.

É por isso que alguns projetos de terapia genética in vivo necessitam de uma abordagem combinada:

Leituras de biodistribuição para a presença a nível tecidual ou evidência relacionada com cópias
Sequenciação direcionada para confirmação de vetor ou região-alvo
Sequenciação do genoma de AAV para suporte à estrutura e sequência do genoma vetorial
Sequenciação de RNA para a expressão de transgenes ou perfilagem da resposta do hospedeiro
Sequenciação de genoma completo ou sequenciação de longas leituras para um contexto genómico mais amplo
Análise do site de integração quando a biologia de vetores e o desenho do estudo o exigem

Ajudamo-lo a decidir quais camadas são necessárias, quais são opcionais e quais podem não ser úteis para o estudo atual.

As Nossas Capacidades de Serviço para Projetos de Biodistribuição em Terapia Génica

Apoiamo projetos de sequenciação de terapia genética in vivo como pacotes de estudo integrados, e não como tarefas isoladas de geração de dados. Antes do início do projeto, a nossa equipa pode rever consigo o tipo de amostra, o design do vetor, os objetivos de leitura, a estratégia de sequenciação, os pontos de controlo de QC e os entregáveis esperados.

Essa revisão inicial é importante. Ajuda a prevenir um problema comum em estudos complexos: gerar dados que são tecnicamente válidos, mas que não estão bem alinhados com a questão biológica.

Sistemas de Vetores e Entrega que Podemos Apoiar

Pesquisa de vetores AAV
Pesquisa de vetores lentivirais ou retrovirais
Estudos de entrega de plasmídeos ou não virais
Estudos de ácidos nucleicos entregues por LNP ou nanopartículas
Contextos de entrega de células engenheiradas ou genes exógenos

Módulos de Sequenciação e Análise

Confirmação do genoma vetor ou da região-alvo
Leituras de biodistribuição tecidual
Perfilagem da expressão de transgenes
Avaliação de evento de integração ou inserção onde aplicável
Comparação multi-tecido ou multi-ponto temporal
Relato e visualização em bioinformática

Apoio à Execução do Projeto

Um projeto sólido começa antes da sequenciação. Ajudamo-lo a rever o tipo e agrupamento de amostras, lista de tecidos e pontos temporais, disponibilidade de mapas ou sequências-alvo, informações de QC de DNA ou RNA, nomeação e rotulagem de amostras, tabelas e figuras de saída pretendidas, e tipos de ficheiros de bioinformática necessários.

Isto ajuda a sua equipa a definir o projeto de forma mais clara e reduz o risco de recolher dados que não conseguem responder à questão original do estudo.

Escolha a Leitura Certa: Biodistribuição, Confirmação de Sequência, Expressão ou Integração

Um bom estudo de terapia génica in vivo não começa com uma plataforma. Começa com a questão que a sua equipa precisa de responder. A tabela abaixo mostra como os resultados comuns diferem e quando cada um pode ser adequado.

Leitura / Método	Pergunta Principal Respondida	Caso de Uso Mais Adequado	Tipo de Amostra Comum	Saídas Típicas	Limitação Importante
quantificação ao estilo qPCR / ddPCR	A sequência alvo é detectável ou quantificável?	Distribuição biodisponível de tecidos, análise relacionada à cópia do vetor, detecção de alvos conhecidos.	Ácido nucleico extraído de DNA ou RNA, derivado de tecido	Tabelas relacionadas com cópias, comparação a nível de tecido, saída de sinal normalizada.	Contexto de sequência limitado; não confirma a estrutura vetorial ampla.
Sequenciação de Região Alvo	A região alvo ou vetor esperado é suportada por leituras?	Confirmação de alvo conhecido, suporte de sequência de vetor baseado em amplicon	DNA, amplicões, regiões-alvo preparadas	Leia suporte, resumo de cobertura, tabela de região-alvo.	Focado em regiões selecionadas; não destinado à descoberta em todo o genoma.
Sequenciação do Genoma AAV	A estrutura ou sequência do genoma do AAV é suportada?	Confirmação da sequência do vetor AAV e QC relacionado ao vetor	DNA vetorial ou material relacionado com AAV preparado	Evidência de sequência vetorial, cobertura, suporte à estrutura da sequência	Focado em vetores; não substitui a análise da biodistribuição a nível tecidual.
Sequenciação de RNA	O transgene está expresso e a resposta do hospedeiro é relevante?	Perfilagem da expressão de transgenes, resposta tecidual, análise a nível de vias.	RNA total de tecido ou células	Matriz de expressão, mapa de calor, tabela de expressão diferencial, saída de via.	O sinal de RNA não é sempre igual à presença de DNA vetor.
Sequenciação do Genoma Completo	É necessário um contexto genómico mais amplo?	Análise de variantes em todo o genoma ou análise de contexto, questões de investigação selecionadas que requerem contexto genómico.	DNA genómico	Tabelas de variantes, dados a nível do genoma, resumo de QC	Mais complexo e nem sempre necessário para uma biodistribuição focada.
Sequenciação de Longo Comprimento	O contexto de sequência de longo alcance é importante?	Contexto estrutural, questões relacionadas com inserções maiores, estudos de vetores ou de integração selecionados.	DNA de alta qualidade ou material preparado	Alinhamento de leituras longas, contexto estrutural, suporte a regiões candidatas	Exige uma entrada de maior qualidade e um design de estudo cuidadoso.
Análise do Site de Integração	Onde são detetados os eventos de inserção de candidatos?	Sistemas lentivirais, retrovirais, de transposões ou outros sistemas relevantes para integração	DNA genómico	Tabela de inserção de candidatos, resumo da localização genómica, visualização	Apenas apropriado quando a biologia do vetor e a questão de estudo o justificam.

Para detalhes sobre serviços relacionados, consulte o nosso Sequenciação do Genoma de AAV, Sequenciação de Região Alvo, Sequenciação do Genoma Completoe Análise de Locais de Integração Lentiviral/Retroviral páginas.

Se a questão principal é onde o material genético é detectado, comece com uma leitura de biodistribuição. Se a questão principal for se o vetor esperado ou a região-alvo está presente e suportada por leituras, adicione sequenciação direcionada ou sequenciação do genoma do vetor. Se a questão principal for se o transgene está expresso, adicionar análise ao nível do RNA.

Se a questão principal é se os eventos relacionados com a inserção são importantesConsidere a análise do local de integração apenas quando o tipo de vetor e o desenho do estudo a tornem relevante. Se a sua equipa precisar de um pacote de dados internos claro, devemos definir os entregáveis de bioinformática antes da submissão das amostras. Isso inclui as tabelas esperadas, figuras, tipos de ficheiros, resumos de QC e notas do relatório.

Fluxo de Trabalho de Amostra para Relatório com Pontos de Verificação de QC

O nosso fluxo de trabalho combina processamento técnico com gestão de projetos. Assim que as amostras entram no projeto, acompanhamos se cada etapa ainda apoia a questão de estudo original.

Sample-to-report workflow for in vivo gene therapy sequencing and biodistribution analysis

Passo 1: Seleção de Receção e Leitura do Projeto

Antes das amostras entrarem no fluxo de trabalho, revemos o desenho do estudo com a sua equipa. Informações úteis incluem o vetor ou sistema de entrega, lista de espécies e tecidos, tecidos-alvo e não-alvo, design dos grupos e pontos temporais, formato da amostra, sequência-alvo ou mapa do construto, resultados desejados e tabelas e figuras de saída esperadas.

Este passo ajuda-nos a decidir se o seu estudo necessita de uma leitura ou de um pacote combinado.

Passo 2: Submissão de Amostras e Revisão Pré-QC

Quando as amostras são preparadas para envio, a rotulagem e a documentação claras são importantes. A CD Genomics pede aos clientes que forneçam um formulário de submissão de amostras preenchido, mantenham os nomes das amostras consistentes entre o formulário e os rótulos dos tubos, e submetam dados de QC eletrónicos quando disponíveis.

Para a submissão de tubos, tubos de centrifugação de 1,5 mL são frequentemente adequados. As placas devem ser seladas hermeticamente para reduzir a perda de amostras ou contaminação cruzada. O DNA em água ou tampão TE deve ser enviado com pacotes de gelo, enquanto o RNA, células, bactérias e tecidos congelados devem ser enviados com gelo seco.

Nesta fase, a nossa equipa verifica a identidade da amostra, o tipo de amostra, a rotulagem e a informação de controlo de qualidade disponível. Se algo não estiver claro, esclarecemos antes que a amostra prossiga para o processamento.

Passo 3: Extração de Ácidos Nucleicos e Controlo de Qualidade

O fluxo de trabalho técnico depende do material de entrada e da leitura selecionada.

Para leituras baseadas em DNA, o DNA extraído deve ser tratado com RNase e não mostrar degradação ou contaminação óbvias. A orientação de amostras da CD Genomics recomenda que a razão OD260/280 do DNA esteja o mais próximo possível de 1,8-2,0.

Para leituras baseadas em RNA, o RNA total deve estar livre de DNA. As orientações da CD Genomics recomendam A260/A280 ≥ 1,8, A260/230 ≥ 1,8 e RIN ≥ 6 para amostras de RNA total.

A revisão de QC pode incluir concentração, pureza, degradação e adequação ao método de sequenciação selecionado. Se a qualidade da amostra não corresponder ao resultado planeado, discutimos possíveis ajustes antes de prosseguir.

Passo 4: Preparação da Biblioteca ou do Ensayo e Sequenciação

Após o QC, o projeto avança para a rota técnica selecionada.

Para sequenciação direcionada, as regiões-alvo são amplificadas ou enriquecidas antes da sequenciação. Para a sequenciação do genoma de AAV, são avaliados o suporte e a cobertura das sequências relacionadas ao vetor. Para a sequenciação de RNA, o RNA é convertido em bibliotecas prontas para sequenciação. Para estratégias de genoma completo ou leituras longas, a preparação da biblioteca depende da qualidade do DNA e do tipo de dados necessário.

O objetivo técnico não é apenas gerar leituras. É gerar dados que correspondam ao resultado biológico planeado.

Passo 5: Bioinformática, Resumo de QC e Entrega do Relatório

Após a sequenciação, processamos os dados em saídas utilizáveis. Dependendo do projeto, isso pode incluir dados brutos e dados limpos, resumo de QC a nível de amostra, suporte de leitura na região-alvo, tabelas de distribuição a nível de tecido, matriz de expressão, tabela de candidatos a locais de integração quando aplicável, resumos visuais, notas de relatório de análise e registos de pipeline e parâmetros quando incluídos.

O pacote final foi criado para ajudar a sua equipa a rever o estudo, comparar grupos e decidir se são necessários experimentos de seguimento.

Requisitos de Amostra para Estudos de Terapia Génica Multi-Tecido

As necessidades de amostras dependem do tipo de vetor, leitura, espécie, tecido e estado de extração. A tabela abaixo fornece pontos de partida práticos com base nas orientações de amostras da CD Genomics e no planeamento comum de projetos de sequenciação. Os requisitos finais devem ser confirmados durante a revisão do projeto.

Tipo de Amostra	Entrada Recomendada	Contentor	Envio	Pontos de Verificação de QC	Notas
Tecido congelado para extração de DNA/RNA	Específico do projeto; para RNA-seq, a orientação do tecido pode começar de 10 a 50 mg, dependendo da aplicação.	Cryotubo ou tubo selado aprovado	Gelo seco	Identidade do tecido, risco de degradação, adequação de DNA/RNA	Fornecer nome do tecido, grupo, ponto temporal, tipo de vetor.
DNA genómico extraído para sequenciação de leitura curta	WGS: ≥500 ng recomendado; WES: ≥500 ng recomendado; sequenciação do genoma viral: ≥1 μg recomendado	tubo livre de DNase	Pacotes de gelo	OD260/280 próximo de 1.8-2.0, concentração, degradação, contaminação	Submeter mapa de construção ou sequência alvo, se disponível.
DNA genómico extraído para sequenciação de longas leituras	PacBio WGS: ≥3 μg; Nanopore WGS: ≥5 μg	tubo livre de DNase	Compressas de gelo	DNA de alto peso molecular, concentração, pureza	Útil quando é necessário um contexto de sequência de longo alcance.
RNA extraído para perfilagem de expressão	Transcrição do genoma completo: ≥3 μg recomendado; mRNA-seq: ≥500 ng recomendado	tubo livre de RNase	gelo seco	A260/A280 ≥1,8, A260/230 ≥1,8, RIN ≥6	Útil para a expressão de transgenes ou perfilagem da resposta do hospedeiro.
Células para trabalho baseado em RNA	A orientação de mRNA-seq pode começar a partir de ≥1×10⁶ células	Formato de tubo aprovado ou célula congelada	gelo seco	Quantidade de células, integridade do RNA após extração	Forneça tipo de célula, grupo, tratamento e leitura alvo.
Amostra de sangue	Para ensaios selecionados, pode ser necessário 0,5-1 mL ou mais, dependendo da leitura.	Recipiente de coleta de sangue anticoagulante em plástico	Embalagem rígida protegida; a condição depende do ensaio.	Integridade da amostra e adequação da matriz	Fornecer tipo de anticoagulante e grupo de estudo.
Amplicão purificado	Sequenciação de amplicons: ≥1 μg recomendado; 500 ng mínimo	Tubo de baixa ligação	Pacotes de gelo	Concentração, banda de alvo único se disponível	Útil para confirmação de região-alvo focada
Partículas virais ou material vetorial	Revisão de viabilidade específica do projeto necessária	Formato congelado aprovado	gelo seco	Identidade, concentração se disponível, construir informação	Útil para a confirmação de sequências relacionadas com vetores.

Análise e Resultados de Bioinformática

A bioinformática deve ser planeada antes do início do sequenciamento. Quando entendemos o seu tipo de vetor, região-alvo, lista de tecidos e objetivos de relatório desde o início, podemos construir um pacote de saída mais útil.

Entregas Mínimas

Dados brutos e dados limpos onde aplicável
Resumo de QC a nível de amostra
Resumo de leituras relacionadas à região-alvo ou ao vetor
Tabela de distribuição a nível de tecido
Ficheiros de visualização básica
Notas de método e análise
Pacote do relatório final

Para projetos que envolvem perfilagem de expressão, os resultados podem incluir matrizes de expressão e mapas de calor. Para projetos que envolvem questões relacionadas à integração, os resultados podem incluir tabelas de inserção de candidatos e resumos de localização genómica.

Adicionais Opcionais

Análise de candidatos para site de integração
Matriz de expressão de RNA e expressão diferencial
Análise da via de resposta do hospedeiro
Comparação de múltiplos pontos de tempo ou múltiplas doses
Visualização personalizada pronta para figuras
Registo de parâmetro de pipeline
Tabela de resumo de leitura cruzada

Bioinformatics deliverables for in vivo gene therapy sequencing and biodistribution analysis

Para projetos a nível de RNA, consulte o nosso Sequenciação de RNA serviço. Para apoio de análise personalizada, consulte o nosso Bioinformática serviços.

Cenários de Aplicação

Estes cenários de estudo ajudam a mostrar como os resultados de sequenciação e biodistribuição podem ser combinados quando a questão de pesquisa requer mais do que uma camada de evidência.

Application scenarios for in vivo gene therapy sequencing and biodistribution analysis

Tropismo Tecidual de AAV e Biodistribuição do Vetor

Os estudos de AAV frequentemente precisam comparar tecidos-alvo com tecidos não-alvo após a administração in vivo. Dependendo do objetivo, o projeto pode combinar leituras de biodistribuição com Análise do Local de Integração do AAV ou sequenciação relacionada ao genoma do AAV.

Avaliação do Local de Inserção de Vetores Lentivíricos ou de Integração

Para sistemas lentivirais, retrovirais, de transposões ou outros relevantes para integração, pode ser necessária uma análise do local de integração para entender os locais de inserção candidatos. Esta análise deve ser considerada apenas quando a biologia do vetor e o desenho do estudo a justificarem.

Estudos de Entrega Não Viral e Persistência de Ácidos Nucleicos

Para sistemas de entrega baseados em plasmídeos, LNP ou nanopartículas, o estudo pode concentrar-se em onde o material de ácido nucleico é detetado, se as regiões-alvo são suportadas por sequenciação e se são necessárias leituras de expressão.

Expressão de Transgenes e Perfil de Resposta a Nível Tecidual

Quando a presença do vetor sozinha não é suficiente, a análise ao nível do RNA pode ajudar a mostrar se a expressão do transgene ou a resposta a nível de tecido fazem parte do conjunto de dados.

Referências

Resultados da Demonstração: Como o Seu Pacote de Dados Pode Parecer

Os resultados da demonstração ajudam a sua equipa a entender como podem ser os resultados finais. Os exemplos abaixo são formatos de resultados comuns que podem ser incluídos quando correspondem ao desenho do estudo.

Demonstração 1: Perfil de Biodistribuição de Tecidos

Um perfil de biodistribuição de tecido pode mostrar como o sinal relacionado ao vetor é distribuído entre tecidos, grupos ou pontos de tempo selecionados. Uma tabela ou gráfico típico pode incluir ID da amostra, tipo de tecido, grupo ou dose, ponto de tempo, sinal alvo, saída normalizada e estado de QC. Esta visualização ajuda a sua equipa a comparar tecidos alvo e não alvo num só lugar.

Vector sequence and target-region confirmation demo result

Demonstração 2: Sequência de Vetores e Confirmação da Região-Alvo

Uma saída de confirmação de sequência pode mostrar se as leituras suportam a região do vetor esperada, a região do transgene ou a sequência alvo selecionada. Uma vista de relatório típica pode incluir a região alvo, contagem de leituras ou suporte de leitura, resumo de cobertura, notas de correspondência de sequência, bandeiras de variantes ou discrepâncias quando relevante, e notas de interpretação de QC.

Expression and integration-related output demo result for gene therapy sequencing

Demonstração 3: Saídas Relacionadas com Expressão e Integração

Para projetos que incluem questões relacionadas com RNA ou integração, uma saída combinada pode mostrar padrões de expressão e informações sobre inserções candidatas. Uma saída típica pode incluir grupo de tecido ou amostra, nível de expressão do transgene, marcadores de resposta do hospedeiro, se incluídos, localização da inserção candidata, quando aplicável, anotação de características genómicas, informações de leituras de suporte e comentários de QC.

FAQ: Planeamento de um Projeto de Sequenciação de Terapia Génica In Vivo

1. Qual leitura devo escolher primeiro?

Comece com a pergunta que precisa de responder. Se precisar de presença a nível tecidual, comece com a biodistribuição. Se precisar de suporte de sequência, adicione sequenciação direcionada ou por vetor. Se precisar de evidência de expressão, adicione análise a nível de RNA. Se eventos relacionados com a inserção forem importantes, a análise do local de integração pode ser útil.

2. Podem ser incluídas amostras de tecido, sangue, ADN e ARN num único projeto?

Sim, mas podem exigir um manuseio, verificações de QC e fluxos de trabalho de sequenciação diferentes. Revisamos primeiro os tipos de amostras e, em seguida, alinhamos cada grupo de amostras com a leitura correta.

3. Quando é que o sequenciamento é mais útil do que o qPCR ou ddPCR isoladamente?

A sequenciação é útil quando a deteção relacionada com cópias não é suficiente. Pode adicionar suporte à região-alvo, informações sobre a sequência do vetor, perfis de expressão, evidências relacionadas com a integração ou um contexto genómico mais amplo.

4. Pode ajudar com a confirmação do genoma do AAV?

Sim. Para trabalhos relacionados com AAV, podemos ajudar a avaliar se o sequenciamento do genoma AAV ou o sequenciamento da região-alvo se adequa ao projeto. A melhor opção depende do design do vetor, do tipo de amostra e da questão que está a ser colocada.

5. Quando deve ser considerada a análise do local de integração?

Considere-o quando o sistema de entrega puder integrar, quando questões relacionadas com a inserção fizerem parte do estudo, ou quando forem necessárias informações sobre a localização genómica. Não é necessário para todos os projetos de biodistribuição.

6. Que informações devo enviar antes de solicitar um plano de projeto?

Informação útil inclui tipo de vetor, espécie, lista de tecidos, pontos temporais, formato da amostra, sequência alvo, mapa do construto, resultados desejados e quaisquer dados de QC de DNA ou RNA existentes.

7. Quais saídas de bioinformática podem ser incluídas?

Dependendo do projeto, os resultados podem incluir resumos de QC, tabelas a nível de tecido, suporte de leitura na região-alvo, matrizes de expressão, tabelas de inserção de candidatos, visualizações e notas de relatório.

8. Esta solução pode suportar designs de múltiplos tecidos e múltiplos pontos de tempo?

Sim. Designs de múltiplos tecidos e múltiplos pontos no tempo são frequentemente uma boa opção para esta solução quando a qualidade da amostra, a agrupamento e os objetivos de leitura são planeados antes do início do sequenciamento.

Caso de Publicação do Cliente: Sequenciação de Evidências em um Estudo de Terapia Génica In Vivo

Caso de Publicação do Cliente

Autoexpansão de células estaminais hematopoiéticas transduzidas por HDAd in vivo pela expressão constitutiva de tHMGA2

Diário: Terapia Molecular: Métodos e Desenvolvimento Clínico
Publicado: 2024
DOI: 10.1016/j.omtm.2024.101319

Fundo

Esta publicação de clientes estudou uma abordagem de terapia génica com células estaminais hematopoiéticas in vivo, projetada para evitar a colheita, manipulação e transplante de células ex vivo. Os autores construíram vetores HDAd5/35++ tropicais para HSC que expressam um gene HMGA2 truncado e um gene reportador GFP. Um vetor de transposase SB100x mediou a integração aleatória do cassete do transgene.

O estudo é relevante aqui porque mostra porque a pesquisa em terapia génica in vivo pode precisar de mais do que um tipo de evidência suportada por sequenciação. Os autores examinaram a expansão celular, o envolvimento de linhagens, o comportamento do local de inserção, a estabilidade genómica e a validação em ratos humanizados.

Métodos

O estudo mobilizou HSCs em ratos utilizando G-CSF e AMD3100/Plerixafor, seguido de injeção intravenosa de um vetor integrador tHMGA2/GFP. Os autores acompanharam as células mononucleares do sangue periférico positivas para GFP ao longo do tempo e avaliaram a expansão entre as HSCs e as populações de progenitores mieloides, linfóides e eritroides na medula óssea e no baço.

Os métodos relacionados com o sequenciamento incluíram a análise de locais de integração em todo o genoma e o sequenciamento do exoma completo. Estes métodos ajudaram os autores a examinar se a expansão era policlonal e se os índices de instabilidade genómica mais amplos diferiam entre os ratos tratados e os de controlo.

Resultados

O artigo relata que as células mononucleares do sangue periférico positivas para GFP mostraram uma expansão lenta, mas progressiva, atingindo cerca de 50% na semana 44. A expansão também foi observada em receptores secundários. Os autores relataram expansão ao nível das células-tronco hematopoiéticas (HSC) e em populações progenitoras na medula óssea e no baço.

Figura 5 apresenta uma análise do local de inserção em todo o genoma através da sequenciação TRACE. A figura inclui fragmentos de DNA contendo locais de inserção únicos, coordenadas de inserção genómica únicas, logótipos de sequência em torno dos locais de inserção, distribuição nas regiões gênicas e visualização da localização de inserção a nível de cromossoma.

Uma observação chave do estudo foi que a expansão era policlonal, sem sinais de dominância clonal com base na análise do local de integração em todo o genoma. O sequenciamento do exoma completo não mostrou diferenças significativas nos índices de instabilidade genómica entre os camundongos tHMGA2/GFP e os camundongos de controlo não tratados.

Figure 5 genome-wide insertion site analysis in an in vivo HDAd-transduced HSC gene therapy study A Figura 5 da publicação do cliente mostra a análise do local de inserção em todo o genoma num estudo de terapia génica com HSC transduzidos por HDAd in vivo, ajudando os leitores a entender como a informação sobre os locais de inserção pode apoiar um pacote de evidências de sequenciação mais amplo.

Conclusão

Esta publicação para clientes mostra por que um plano de sequenciação de múltiplas leituras pode ser útil na investigação em terapia genética in vivo. Dependendo do sistema de vetor e do objetivo do estudo, um projeto pode precisar de evidências a nível de tecido, confirmação a nível de sequência, informações sobre o local de inserção, dados de expressão e um contexto genómico mais amplo.

Para um projeto de serviço, a lição prática é simples: defina a questão primeiro, depois construa o plano de sequenciação e bioinformática em torno dessa questão.

Referência

Auto-expansão de células estaminais hematopoiéticas transduzidas por HDAd in vivo através da expressão constitutiva de tHMGA2

Publicações Relacionadas com Clientes

As publicações abaixo são relevantes para terapia génica, entrega de vectores, sequenciação ou contextos de investigação sobre resposta imunitária. Estão listadas como publicações de clientes relacionadas, e não como estudos de caso completos.

Publicação	Diário / Ano	Etiqueta de Serviço Relacionada	Por Que É Relevante
Auto-expansão de células estaminais hematopoiéticas transduzidas por HDAd in vivo pela expressão constitutiva de tHMGA2	Terapia Molecular: Métodos e Desenvolvimento Clínico, 2024	Sequenciação do Exoma Completo, SEC	Ajuste mais próximo para o caso de publicação do cliente; relevante para terapia genética in vivo e avaliação genómica.
A edição de base in vivo resgata a ADPKD num modelo de rato humanizado.	Nature Communications, 2025	Construção de Bibliotecas de RNA-seq e Sequenciação de RNA-seq	Relevante para a edição de base entregue por AAV in vivo e análise de edição de RNA em todo o transcriptoma.
Os imunopetidomas da classe I do HLA das proteínas do capsídeo do AAV	Frontiers in Immunology, 2023	Tipagem HLA	Relevante para a pesquisa do imunopetidoma do capsídeo AAV e o contexto da resposta imune à entrega de genes.

Ver mais artigos publicados pelos nossos clientes.

Solução de Análise de Sequenciação e Biodistribuição de Terapia Génica In Vivo