Diretrizes para Submissão de Amostras
Introdução – Por Que a Análise de ARG é Importante
A resistência a antibióticos é reconhecida pelo Organização Mundial da Saúde como uma das 10 principais ameaças à saúde global.Infecções resistentes aumentam a mortalidade e falhas no tratamento, enquanto os genes de resistência persistem no ambiente, muitas vezes ocultos em plasmídeos e elementos móveis que se espalham por espécies. Os métodos de diagnóstico tradicionais são lentos, fragmentados e frequentemente falham em detectar genes de resistência de baixa abundância ou novos.
CD Genomics' Análise de Genes de Resistência a Antibióticos Baseada em Sequenciamento supera estas barreiras. Ao fornecer leituras completas e dados em tempo realo nosso serviço permite:
- Classificação abrangente de genes de resistência a antibióticos em plasmídeos, cromossomas e elementos integrativos.
- Anotação precisa utilizando bases de dados curadas de genes de resistência a antibióticos.
- Predição precisa de genes de resistência a antibióticos, incluindo marcadores de resistência de plasmídeos de baixa cópia que são ignorados por plataformas de leitura curta.
O que Entregamos – Principais Capacidades
- Deteção completa de ARG: Genes de resistência a antibióticos conhecidos em cromossomas, plasmídeos e elementos genéticos móveis (EGMs).
- Anotação e classificação precisas de ARG utilizando bases de dados de genes de resistência a antibióticos curadas (por exemplo, CARD, ARO).
- Localização de ARGs em plasmídeos versus cromossomos para avaliar o risco de transferência horizontal de genes.
- Previsão da transferibilidade de ARG e atribuição a hospedeiros/taxas microbianos.
- Perfil de abundância e diversidade das classes de ARG nas suas amostras.
- Design flexível: suporta análise em tempo real ou sequenciação híbrida (Nanopore + leituras curtas) conforme as necessidades do projeto.
Fluxo de Trabalho Detalhado
| Passo | Descrição | Principais Passos e Ferramentas Técnicas | Medidas de Saída e Qualidade |
|---|---|---|---|
| Amostragem de QC e Extração de DNA | Aceita uma variedade de tipos de amostras: isolados, metagenomas, ambientais, clínicos, agrícolas. | Extrair DNA de alto peso molecular; avaliar a pureza e integridade; quantificar DNA. | Métricas de QC (rendimento, pureza, tamanho de fragmento) para garantir a precisão a montante. |
| Preparação de Biblioteca e Sequenciação | Prepare amostras para sequenciação; suporta codificação de barras / multiplexação se necessário. | Utilize kits de biblioteca apropriados; configure células de fluxo; otimize para o comprimento da leitura. | Conjuntos de dados de leitura bruta com leituras longas de alta qualidade. |
| Basecalling e Processamento de Leituras | Converter sinais brutos em leituras; filtrar e limpar as leituras antes da análise posterior. | Utilize a chamada de base de alta precisão (por exemplo, Guppy), aparo de adaptadores, filtragem de leituras de baixa qualidade/curtas. | FASTQs limpos; distribuição da qualidade das leituras; métricas de comprimento. |
| Construção de Montagens e Contigs (Opcional / Híbrido) | Se desejado, construa sequências contíguas mais longas para resolver complexos de ARG. | Assemblers (por exemplo, Flye), polimento (por exemplo, Racon, Medaka), polimento híbrido se estiverem envolvidos leituras curtas. | Melhor N50 de contig, conteúdo genético mais completo, melhor clareza estrutural. |
| Deteção de ARG e Anotação de Base de Dados | Mapeia leituras/contigs contra bases de dados de ARG; classifique tipos e mecanismos de resistência. | Utilize ferramentas para alinhar ao CARD/ARO; agrupar ARGs semelhantes; identificação taxonómica de hospedeiros. | Lista de ARGs com classificação (família de genes, mecanismo), anotação de espécies/taxa. |
| Atribuição de Plasmídeo / Cromossoma e Detecção de MGE | Determine se os ARGs estão localizados em plasmídeos ou cromossomas; identifique elementos genéticos móveis. | Ferramentas de deteção de plasmídeos (por exemplo, MOB-suite ou equivalentes); deteção de integrões, transposões, ICEs; visualização de clusters de genes. | Mapeamento de ARGs para contexto plasmidial ou cromossómico; mapas visuais de clusters de genes; indicadores de transferibilidade. |
| Relatório e Visualização | Gerar resultados destinados a investigação, publicação ou uso regulamentar. | Tabelas de abundância; mapas de genes anotados; gráficos comparando ARGs entre amostras; informações filogenéticas ou contextuais do hospedeiro. | Figuras prontas para publicação; tabelas de anotação completas; visualização clara da localização e mobilidade dos genes. |
Capacidades de Análise em Bioinformática
| Categoria de Análise | Análise Básica | Análise Avançada | Análise Integrada Multi-Ómica |
|---|---|---|---|
| Deteção e Anotação de ARG | Identificar genes de resistência a antibióticos conhecidos (ARGs) alinhando leituras/contigs a bases de dados de genes de resistência a antibióticos curadas (por exemplo, CARD, ARO); classificar por família de genes, mecanismo de resistência. | Prever ARGs novos ou de baixa homologia; analisar clusters de genes ARG (genes co-localizados), elementos genéticos móveis (transposões, integrons); anotação funcional dos mecanismos de resistência. | Combinar dados metagenómicos + transcriptómicos para determinar quais ARGs estão expressos; proteómica para verificar a produção de enzimas de resistência; correlacionar a presença de ARG com dados fenotípicos ou níveis de expressão. |
| Mapeamento de Hospedeiro / Taxonomia | Atribuir ARGs a níveis taxonómicos (espécie, género, família) utilizando ferramentas de classificação. | Co-localização de ARGs com genomas microbianos hospedeiros; construir rede ARG-hospedeiro; inferir gama de hospedeiros e potencial de disseminação. | Integre metatranscriptoma ou dados de célula única para ver os hospedeiros ativos; combine com 16S/shotgun para diversidade; ligue a expressão/proteoma à identidade do hospedeiro. |
| Plasmídeo vs Cromossoma e Mobilidade | Distinguir se os ARGs são transportados por plasmídeos ou cromossomos; deteção de MGEs conhecidos. | Mapeamento detalhado das estruturas de plasmídeos, deteção de novos eventos de fusão de plasmídeos; identificação de sequências de inserção, elementos conjugativos integrativos; estimativa do número de cópias de plasmídeos. | Utilize sequências de leitura longa + leitura curta (híbridas) juntamente com transcriptómica / proteómica para confirmar o uso ativo de elementos móveis; combine com dados de metilação ou epigenómica para avaliar a regulação da mobilidade. |
| Perfil de Abundância e Diversidade | Quantificar a abundância de ARG (contagens normalizadas), métricas de diversidade (por exemplo, Shannon, Simpson), comparar entre amostras. | Abundância diferencial entre condições; rede de coocorrência de classes de ARG; aprendizagem automática para detetar ARGs marcadores; deteção de tendências. | Compare metagenoma vs metatranscriptoma: abundância vs expressão; correlacionar metadados ambientais/clínicos com a diversidade de ARG; integrar metabolómica/variáveis ambientais para detetar pressões de seleção. |
| Visualização e Relatórios | Saídas visuais básicas: gráficos de barras, mapas de calor, tabelas de classificação de ARG. | Mapas de cluster de ARG, diagramas de plasmídeo vs cromossoma, gráficos de rede de hospedeiro-ARG, visualizações de contexto de elementos móveis. | Painéis visuais multi-ómicos: expressão vs número de cópias de genes, coocorrência entre ómicas, PCA/PCoA / diagramas de rede mostrando relações ómicas. |
| Controlo de Qualidade e Confiança | Filtragem por qualidade de leitura, identidade mínima de alinhamento e cobertura; limitação para reduzir falsos positivos; uso de bases de dados curadas de genes de resistência a antibióticos. | Validação de ARGs de baixa abundância; suporte à profundidade de cobertura; validação cruzada entre leituras/montagens; avaliação do contexto genético; utilização de múltiplos bancos de dados/modelos. | Validação cruzada ómica: confirmação da expressão, evidência proteómica; consistência entre conjuntos de dados; validação ambiental ou fenotípica quando disponível. |
Garantia de Qualidade
- Uso de bases de dados de genes de resistência a antibióticos curadas para reduzir falsos positivos.
- Apenas correspondências de alta confiança são anotadas (com base na similaridade de sequência, cobertura, contexto taxonómico).
- Verificação do contexto ARG (vizinhos de genes, elementos móveis) para garantir a precisão das atribuições.
- Dados entregues com transparência: métricas de QC, estatísticas de montagem, distribuições de comprimento/qualidade de leitura.
Aplicações da Análise de ARG
O nosso serviço de Análise ARG suporta uma ampla gama de aplicações em investigação, vigilância e ciência aplicada. Abaixo estão os principais casos de uso para laboratórios académicos, CROs e instituições.
Pesquisa Clínica e de Patógenos
- Detetar genes de resistência a antibióticos ocultos ou de baixa abundância, especialmente ARGs mediadas por plasmídeos, em isolados clínicos.
- Prever fenótipos de resistência a partir de dados genómicos para apoiar a investigação sobre a função de ARG, comparação de estirpes, teste de hipóteses e compreensão dos mecanismos de resistência.
- Monitorizar a resistência emergente (por exemplo, novas carbapenemases) antes que se espalhe.
Vigilância Ambiental e Saúde Pública
- Rastrear ARGs em estações de tratamento de águas residuais, rios, solo e escoamento agrícola para monitorizar a dinâmica do resistoma ambiental.
- Avaliar a mobilidade dos ARGs através de plasmídeos e elementos genéticos móveis (EGMs) para compreender os riscos de transferência horizontal de genes.
Investigação Agrícola e Veterinária
- Estudar as estruturas do resistoma em gado, microbiomas animais, esterco e sistemas de produção de alimentos.
- Avaliar os impactos do uso de antibióticos na agricultura através da ligação de ARGs a plasmídeos ou MGEs para risco de transferência.
Ecologia Microbiana e Pesquisa Fundamental
- Estudar a classificação e diversidade de ARG em comunidades microbianas.
- Investigar a coocorrência de ARGs com outros tipos de genes (por exemplo, genes de resistência a metais), para compreender as pressões de co-seleção.
- Resolver o contexto completo do gene e o background genético (cromossoma vs plasmídeo, elementos vizinhos) que leituras curtas não conseguem capturar adequadamente.
Monitorização em Tempo Real e Desdobrável em Campo
- Ambientes de ponto de atendimento ou in situ (clínicas, locais de campo) beneficiam de fluxos de trabalho de deteção de ARG em tempo real.
- Sistemas de alerta precoce para rastreamento de surtos, eventos de contaminação ambiental e ameaças de resistência emergentes.
Entregáveis
- Ficheiros de leitura brutos e processados (FASTQ / FASTA)
- Contigs montados ou sequências de plasmídeos, se solicitado.
- Tabelas ARG anotadas: nomes de genes, classe, mecanismo, antibiótico(s) associado(s)
- Relatórios de atribuição de plasmídeo vs cromossoma
- Perfis de abundância e diversidade de ARGs por amostra
- Visualizações: mapas genéticos, diagramas de clusters, contexto de hospedeiro/filogenia
- Documentação completa dos métodos e relatório de QC para garantir a reprodutibilidade.
Perguntas Frequentes
Q: O que é um serviço de Análise de Genes de Resistência a Antibióticos e como pode ajudar a minha pesquisa?
A Análise de Genes de Resistência a Antibióticos é um serviço que utiliza sequenciação (por exemplo, leituras longas de Nanopore) e bioinformática para detetar, classificar e anotar genes de resistência a antibióticos (ARGs) nas suas amostras; ajuda laboratórios, clientes de CRO e instituições académicas a descobrir tipos de ARG (transportados por plasmídeos ou cromossomais), prever mecanismos de resistência, rastrear elementos genéticos móveis e quantificar a abundância de ARG para apoiar vigilância, diagnósticos ou estudos agrícolas/ambientais.
Q: Quão precisa é a classificação e anotação de ARG utilizando bases de dados de genes de resistência curadas?
Ao utilizar bases de dados de genes de resistência a antibióticos curadas (como CARD/ARO/SARG), combinadas com leituras longas de alta qualidade (por exemplo, do Nanopore), a anotação e classificação dos ARGs são muito precisas; os limiares de correspondência (identidade, cobertura) garantem que os genes sejam corretamente atribuídos, e a atribuição de plasmídeos versus cromossomas fornece contexto para ARGs móveis, reduzindo a má classificação e ajudando na previsão de resistência.
P: Conseguem distinguir os ARGs em plasmídeos dos que estão em cromossomas, e por que isso é importante?
Sim, parte do fluxo de trabalho de análise envolve a atribuição de plasmídeo vs cromossoma através da deteção de sequências de plasmídeos e elementos genéticos móveis (EGMs), para que possamos determinar se um ARG é provavelmente transferível; esta distinção é importante porque os ARGs transportados por plasmídeos se espalham mais facilmente entre as bactérias, aumentando o risco, e conhecer a localização melhora a compreensão da mobilidade genética e da epidemiologia.
Q: Preciso de um volume maior ou de uma qualidade especial de DNA para a deteção de ARG?
Para alcançar uma deteção fiável, especialmente para ARGs de baixa abundância ou localização de plasmídeos, prefere-se DNA de alto peso molecular com boa pureza; embora possamos trabalhar com uma variedade de tipos de amostras, a filtragem de qualidade e as etapas de preparação da biblioteca são otimizadas para reduzir o ruído e melhorar a confiança na previsão de genes de resistência a antibióticos.
Q: Como garantem baixos falsos positivos na deteção e previsão de ARG?
Utilizamos pipelines de bioinformática rigorosos, incluindo controlo de qualidade de basecalling, aparo de leituras, alinhamento a bases de dados de genes de resistência a antibióticos curadas, filtragem por identidade de sequência e limiares de cobertura, e verificação do contexto do gene (elementos móveis vizinhos ou atribuição a cromossomas/plasmídeos) para que as previsões de genes de resistência a antibióticos sejam robustas e fiáveis.
P: Este serviço pode ser utilizado tanto para amostras clínicas como para amostras ambientais ou agrícolas?
Sim, esta análise de ARG é aplicável a uma variedade de tipos de amostras—isolados clínicos, águas residuais, solo, microbiomas de gado, etc.—uma vez que os métodos detetam ARGs em diversas comunidades microbianas; as mesmas capacidades de classificação, anotação e atribuição de plasmídeos aplicam-se, embora a preparação da amostra e a profundidade possam variar dependendo do ambiente ou tipo de matriz.
Q: Que tipo de resultados e relatórios vou receber do serviço de análise ARG?
Você receberá tabelas anotadas de ARGs (nome do gene, mecanismo/classe, taxa hospedeira), perfis de abundância e diversidade, mapas de localização de plasmídeos vs cromossomos, visualizações (mapas de calor, diagramas de agrupamento de genes, gráficos de rede), arquivos de sequência brutos e processados, e documentação de métodos/controle de qualidade para reprodutibilidade.
Q: Quais serviços de sequenciação relacionados podem complementar a Análise ARG?
Serviços como Sequenciação Ultra-Longa Nanopore, Sequenciação de Amplicons Nanopore, Sequenciação Alvo Nanopore, Sequenciação de lncRNA de Comprimento Total Nanopore, Sequenciação de Transcritos de Comprimento Total Nanopore, Sequenciação Direta de RNA Nanopore e a visão geral da Sequenciação Nanopore são todas ofertas complementares que podem melhorar a deteção de genes de resistência a antibióticos (por exemplo, leituras ultra-longas ajudam a resolver grandes plasmídeos, abordagens de amplicon ou direcionadas ajudam a validar genes específicos), aumentando a compreensão geral da localização, classificação e anotação de plasmídeos de genes de resistência a antibióticos.
Estudo de Caso: Resistoma e Microbioma Intestinal em Pacientes Hospitalizados, Sul do Brasil
Fonte: Fronteiras em Antibióticos (2025)
DOI: 10.3389/frabi.2024.1489356
1. Contexto
A resistência antimicrobiana é um desafio crítico de saúde global. Os pacientes hospitalizados são particularmente vulneráveis devido à exposição a antibióticos e a microbiomas alterados. Este estudo investigou o resistoma intestinal e a composição do microbioma de pacientes admitidos em um hospital no sul do Brasil, uma região com atividade pecuária intensiva que aumenta a exposição ambiental a ARG.
2. Métodos
- Coleta de amostras: Amostras fecais de pacientes na admissão e na alta.
- Sequenciação: Sequenciação metagenómica de DNA microbiano.
- Bioinformática: deteção de ARG contra bases de dados de genes de resistência a antibióticos curadas, quantificação do resistoma e perfilagem taxonómica do microbioma.
- Comparações: Perfis de admissão vs. alta para identificar a dinâmica do resistoma durante a hospitalização.
3. Resultados
- Alta prevalência de genes de resistência a aminoglicosídeos e tetraciclinas nos microbiomas de pacientes.
- Os genes mcr (que conferem resistência à colistina) foram detetados tanto na admissão como na alta.
- A diversidade do resistoma aumentou durante a hospitalização, com alguns ARGs enriquecidos após o tratamento com antibióticos.
- Alterações na composição do microbioma (por exemplo, aumento de Enterobacteriaceae) foram associadas a mudanças no resistoma.
Figura. Composição do resistoma em pacientes internados, comparando amostras de admissão e alta. As classes de genes aminoglicosídeos, tetraciclinas e mcr são destacadas como contribuintes dominantes.
4. Conclusões
- A hospitalização e a exposição a antibióticos podem expandir o resistoma intestinal, enriquecendo ARGs clinicamente importantes.
- A persistência dos genes mcr levanta preocupações sobre a resistência à colistina transferível.
- A análise integrada do microbioma e do resistoma fornece informações acionáveis para a gestão de antibióticos e controlo de infeções.
- Este caso demonstra o valor da vigilância de ARG utilizando metagenómica em contextos clínicos.
Referências:
- Coltro EP, Cafferati Beltrame L, da Cunha CR, Zamparette CP, Feltrin C, Benetti Filho V, Vanny PA, Beduschi Filho S, Klein TCR, Scheffer MC, Palmeiro JK, Wagner G, Sincero TCM, Zárate-Bladés CR. Avaliação do resistoma e da composição do microbioma intestinal de pacientes internados em uma unidade de saúde do sul do Brasil, oriundos de uma região de alta produção pecuária.. Antibiótico Frontal2025 Jan 17;3:1489356. doi: 10.3389/frabi.2024.1489356. PMID: 39896720; PMCID: PMC11782142.
- Peter S, Bosio M, Gross C, Bezdan D, Gutierrez J, Oberhettinger P, Liese J, Vogel W, Dörfel D, Berger L, Marschal M, Willmann M, Gut I, Gut M, Autenrieth I, Ossowski S. Rastreamento da Transferência de Resistência a Antibióticos e Evolução Rápida de Plasmídeos em Ambiente Hospitalar por Sequenciação Nanoporosa. mSphere. 2020 19 de agosto;5(4):e00525-20. doi: 10.1128/mSphere.00525-20. PMID: 32817379; PMCID: PMC7440845.
- Arango-Argoty, G.A., Dai, D., Pruden, A. et al. NanoARG: um serviço web para detetar e contextualizar genes de resistência antimicrobiana a partir de metagenomas derivados de nanopore. Microbioma 7, 88 (2019).
