Sequenciação Metagenómica Viral

Como um fornecedor experiente de serviços de NGS e parceiro da Illumina, a CD Genomics está comprometida em oferecer quantidades sem precedentes de dados de sequenciamento, permitindo abordagens analíticas rápidas e inovadoras com soluções rentáveis. Temos uma forte experiência em fornecer um serviço de sequenciamento metagenómico viral confiante e imparcial, utilizando sequenciadores de alto rendimento de última geração, estratégias de sequenciamento e bioinformática pipelines.

Introdução ao Sequenciamento Metagenómico Viral

Os vírus são as entidades biológicas mais abundantes no mundo, superando o número de células microbianas na proporção de 10:1 na maioria dos ambientes. Os vírus habitam constantemente o nosso corpo, e os hospedeiros assintomáticos não são exceção. Esta visão emergente levanta a necessidade de explorar o viroma. A metagenómica viral pode fornecer informações sobre a composição e estrutura das comunidades virais. O perfil da composição taxonómica das comunidades virais é importante não apenas para a investigação básica, mas também para a ciência e prática clínica.

No entanto, as comunidades virais são difíceis de caracterizar porque não existe um único gene que seja partilhado por todos os genomas virais, o que limita a aplicação de métodos análogos utilizados em bactérias para o perfilamento de DNA ribossómico. A baixa abundância de DNA livre e celular é outro desafio. Sequenciação metagenómica por shotgun e RNA-seq Existem duas abordagens para a caracterização de comunidades virais. A sequenciação direta pode resultar em um elevado fundo de materiais genéticos. Portanto, são necessários procedimentos adicionais para concentrar e purificar partículas virais (PVs). Vários métodos de enriquecimento viáveis foram sugeridos, incluindo filtração, ultracentrifugação, tratamento com nucleases, amplificação de deslocamento múltiplo (MDA), biblioteca de shotgun amplificada por ligadores (LASL) e abordagem de PCR aleatória.

Vantagens do Sequenciamento Metagenómico Viral

• Não é necessário realizar cultivos ou testes laboratoriais de anticorpos.
• Informação abrangente sobre biodiversidade comunitária, taxonomia e função.
• As aplicações promissoras incluem a descoberta de vírus e a identificação de patógenos virais associados à horticultura, medicina veterinária e saúde humana, especialmente para casos de difícil diagnóstico.

Aplicação do Sequenciamento Metagenómico Viral

(1) Tratamento de Doenças: O estudo da diversidade viral, a descoberta de vírus desconhecidos, a análise de deteção de vírus/bacteriófagos específicos e a interação entre bactérias e bacteriófagos (em aspetos como o intestino, a pele, o ambiente, etc. e em relação à saúde) são elementos vitais a abordar. A investigação das relações entre vírus e doenças (como doenças metabólicas, doenças gastrointestinais, doenças respiratórias, alergias, doenças infeciosas, doenças orais e tumores) pode aumentar significativamente a nossa compreensão. Técnicas como a terapia com bacteriófagos e a sensibilização de bactérias resistentes a antibióticos podem potencialmente estimular respostas imunes.

(2) Segurança Alimentar: Monitorizar vírus nos alimentos, compreender a diversidade viral transmitida por alimentos, investigar patógenos transmitidos através dos alimentos e monitorizar vírus durante o processamento alimentar são medidas-chave. Rastrear incidentes de contaminação viral e estudar a ligação entre vírus e o microbioma alimentar pode contribuir substancialmente para garantir a segurança alimentar.

(3) Indústria Pecuária: A gestão de doenças na reprodução animal, como o tratamento da diarreia, febre suína, febre aftosa, doenças zoonóticas e a análise de fezes de animais selvagens, é significativa para a manutenção da saúde do gado.

(4) Monitorização de Doenças Infecciosas: A monitorização de vírus ambientais pode fornecer deteção precoce e pistas de vigilância para surtos de doenças, contribuindo significativamente para iniciativas de saúde pública.

(5) Engenharia Ambiental: Nas atividades de engenharia ambiental, como o tratamento de águas residuais e o controlo da poluição, compreender as comunidades virais em corpos de água ajuda a avaliar a eficácia do tratamento e o impacto ambiental. Isso aplica-se a vários ambientes, como sistemas de transporte público, hospitais, oceanos, corpos de água doce, ar e glaciares.

(6) Descoberta de Fármacos: A investigação do viroma pode revelar vírus que possam interagir com os hospedeiros, fornecendo pistas para a descoberta de novos fármacos.

(7) Agricultura: O estudo da diversidade viral de plantas e solos pode apoiar o desenvolvimento de biopesticidas no setor agrícola.

Fluxo de Trabalho de Sequenciação Metagenómica Viral

A nossa equipa de especialistas altamente experientes executa a gestão de qualidade seguindo cada procedimento para garantir resultados abrangentes e precisos. O fluxo de trabalho geral para o sequenciamento shotgun metagenómico viral está delineado abaixo. Resumidamente, os passos básicos envolvidos na metagenómica viral incluem a isolação e purificação de partículas virais por filtração por tamanho ou centrifugação baseada em densidade, amplificação independente de sequência do ácido nucleico viral, sequenciamento shotgun ou RNA-seq e análises correspondentes sobre diversidade, taxonomia e função através de uma bateria de ferramentas de bioinformática fiáveis.

Especificações do Serviço

	Requisitos de amostra Fontes de amostras, incluindo amostras ambientais e clínicas. Controlo de qualificação de amostras Isolamento e purificação de VPs e amplificação independente de sequência
	Plataformas de Sequenciação Plataformas HiSeq, paired-end 150 bp, MGI DNBSEQ-T7/DNBSEQ-G400 Mais de 2 Gb de dados brutos por amostra Mais de 80% das bases com uma pontuação de qualidade ≥Q30 SMRT da PacBio a tecnologia também está disponível para sequenciação de longos fragmentos, que fornece sequências mais precisas e contíguas.
	Análise BioinformáticaFornecemos múltiplas análises de bioinformática personalizadas: A remoção da contaminação relacionada ao hospedeiro e à bactéria Alinhamento de nucleotídeos (VirFinder, VirusFinder e BLAST) Alinhamento de proteínas (RefSeq) De novo montagem, identificação taxonómica, gráfico de cobertura e análise filogenética ...e mais

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Controlo de Qualidade e Remoção de Anfitriões
• Análise de Espécies de Leituras
• Assembleia
• Análise de Espécies Montadas
• Análise Funcional
• Predição de Hospedeiros de Fagos

Além do sequenciamento metagenómico viral qualificado, oferecemos assistência, incluindo o design experimental, a determinação da plataforma de sequenciamento apropriada, ferramentas de software e metodologias de análise, para acomodar o seu projeto. Se tiver requisitos adicionais ou perguntas, não hesite em contactar-nos; os nossos especialistas experientes estão disponíveis para o ajudar a resolver as suas questões.

Referências:

1. Li Y, et al. VIP: um pipeline integrado para metagenómica de identificação e descoberta de vírus. Relatórios científicos, 2016, 6: 3774
2. Rampelli, S. et al. ViromeScan: uma nova ferramenta para o perfilamento da comunidade viral metagenómica. BMC Genómica. 2016, (17):165.
3. Lewandowska D W, Zagordi O, Geissberger F D, et al. Otimização e validação da preparação de amostras para sequenciação metagenómica de vírus em amostras clínicas. Microbioma, 2017, 5(1): 94.

Os resultados parciais estão mostrados abaixo:

Por sequência de base contida.

Conteúdo de GC por sequência.

abundância_fundida.

Mapa de calor de abundância a nível de família.

Classificação KEGG.

Classificação de funções CAZy.

Análise de boxplot com base em bray Curtis (A), jaccard binário (B), unweighted unifrac (C) e weighted unifrac (D).

Análise PCoA baseada em Bray-Curtis (A), Jaccard binário (B), unifrac não ponderado (C) e unifrac ponderado (D).

Árvore de agrupamento UPGMA.

1. Quais são as abordagens para o sequenciamento do genoma completo de patógenos?

Atualmente, existem três abordagens principais para sequenciação do genoma completo de patógenos, ou seja, sequenciação metagenómicasequências de interesse, permitindo uma análise mais focada e eficiente. genoma viral numa única reação, que diminui a carga de trabalho mas aumenta o custo em comparação com o sequenciamento de amplicons por PCR. As vantagens e desvantagens estão listadas na Tabela 1. Ela mostra que o sequenciamento metagenómico viral tem as vantagens únicas de investigar patógenos e caracterizar a diversidade viral em amostras ambientais e clínicas.

Figura 1. As principais abordagens utilizadas para o sequenciamento do genoma viral (Houldcroft et al. 2016).

Tabela 1. Vantagens e desvantagens de diferentes métodos de sequenciação de genomas virais (Houldcroft et al. 2016).

2. Qual é o pipeline geral de bioinformática para sequenciação metagenómica viral?

Após o sequenciamento, as leituras brutas de NGS são primeiro pré-processadas pela remoção de adaptadores, sequências de baixa qualidade e baixa complexidade, seguidas pela subtração computacional de leituras relacionadas ao hospedeiro. Em um modo rápido, os vírus são identificados por alinhamento à base de dados de nucleotídeos ViPR/IRD. Em um modo mais sensato, as leituras de RNA ribossómico bacteriano e relacionado são removidas antes do alinhamento à base de dados de vírus. As leituras não correspondentes são posteriormente alinhadas a uma base de dados de proteínas virais (NCBI RefSeq DB). Em seguida, a identificação taxonómica (Taxl), o gráfico de cobertura (Covplot), de novo a montagem (vários k-mer) e a análise filogenética (PhyGo) podem ser realizadas.

Referências:

1. Houldcroft C J, Beale M A, Breuer J. Perspectivas clínicas e biológicas a partir do sequenciamento do genoma viral. Nature Reviews Microbiology, 2017, 15(3): 183-192.
2. Li Y, Wang H, Nie K, et al. VIP: um pipeline integrado para metagenómica de identificação e descoberta de vírus. Relatórios científicos, 2016, 6.

Deteção e sequenciação do vírus Zika a partir do líquido amniótico de fetos com microcefalia no Brasil: um estudo de caso

Revista: The Lancet Infectious Diseases

Fator de impacto: 19,864

Publicado: 17 de fevereiro de 2016

Fundos

Os casos de microcefalia no Brasil em 2015 foram 20 vezes mais do que em anos anteriores. Dados epidemiológicos sugerem que a incidência de microcefalia no Brasil pode estar associada ao vírus Zika. Os autores recolheram amostras de líquido amniótico de duas mulheres grávidas no Brasil cujos fetos foram diagnosticados com microcefalia, numa tentativa de investigar a causa da microcefalia.

Métodos

Resultados

1. Montagem do genoma do vírus Zika

Após a remoção da contaminação celular, 288 904 sequências apresentaram semelhança com genomas virais, e 683 sequências corresponderam ao genoma do vírus Zika. A Figura 1 mostra o genoma completo do vírus Zika isolado do paciente 1 com anotação de genes.

Figura 1. Diagrama do Atlas de BLAST genómico comparativo do vírus Zika. O círculo verde corresponde ao vírus Zika brasileiro completo isolado do paciente 1. O círculo vermelho corresponde à estirpe do vírus Zika do Senegal. O círculo azul corresponde à estirpe de Uganda.

2. Análise filogenética

As análises filogenéticas foram realizadas com a região codificadora para os genes do envelope (Figura 2) e NS5 (Figura 3), respetivamente. A região geográfica da estirpe do vírus Zika brasileiro não pôde ser inferida devido a limitações de amostragem, mas parecia estar mais relacionada com a Polinésia Francesa do que com estirpes africanas.

As distribuições geográficas e cronológicas das linhagens do vírus Zika indicaram que a estirpe do sudeste asiático poderia ter-se isolado geneticamente das estirpes africanas durante aproximadamente 50 anos. Este padrão foi ainda confirmado pela distância genética entre as novas sequências do vírus Zika brasileiro e o genoma do vírus Zika ugandense (Figura 4).

Figura 2. Topologias de máxima verossimilhança da região genómica do envelope do vírus Zika brasileiro.

Figura 3. Topologias de máxima verossimilhança da região genómica NS5 do vírus Zika brasileiro.

Figura 4. Filogenia de máxima verossimilhança do vírus Zika brasileiro, outros genomas de Flaviviridae e um genoma de alfavírus. DENV=vírus da dengue, JEV=vírus da encefalite japonesa. YFV=vírus da febre amarela. ZIKA=vírus Zika.

A infecção pelo vírus Zika pode ocorrer através da transmissão transplacentária.

Este artigo foi o primeiro a isolar o genoma completo do vírus Zika a partir do líquido amniótico, o que sugeriu que a infecção pelo vírus Zika poderia ocorrer através da transmissão transplacentária.

Referência:

1. Calvet G, Aguiar R S, Melo A S O, et al. Detecção e sequenciação do vírus Zika a partir do líquido amniótico de fetos com microcefalia no Brasil: um estudo de caso. The Lancet doenças infeciosas, 2016, 16(6): 653-660.