Diretrizes para Submissão de Amostras
O que é Sequenciamento por PCR Multiplex?
A sequenciação por PCR multiplex da CD Genomics combina a reação em cadeia da polimerase multiplex (PCR) com sequenciação de nova geração (NGS). Utiliza múltiplos pares de primers em um único tubo de reação para amplificar simultaneamente numerosas regiões genómicas específicas (contendo SNPs-alvo). Os amplicons agrupados são então sequenciados em plataformas NGS de alto rendimento (como Illumina MiSeq/NovaSeq), permitindo o genotipagem paralela de centenas de SNPs em muitas amostras. Este método é altamente específico, sensível e eficiente para estudos focados.
Utilizamos o nosso software proprietário AIdesign e MFEprimer para o design de primers multiplex e controlo de qualidade, desenvolvido com a orientação de especialistas reconhecidos internacionalmente. Esta solução de ponta fornece primers específicos para genomas inteiros com base em algoritmos de estabilidade termodinâmica, adaptados para atender às suas necessidades de pesquisa. Com a capacidade de multiplexar até 5.000 reações em um único tubo e requisitos de entrada tão baixos quanto 100 pg de gDNA, este método enriquece rapidamente e de forma eficiente regiões-alvo para sequenciação precisa. Oferecemos dois formatos de design flexíveis—tubo único ou múltiplos tubos—com base no tipo da sua região-alvo.
Design de primers e fluxo de trabalho de PCR multiplex. O fluxograma descreve o processo de seleção e otimização de primers para a amplificação por PCR, garantindo que não haja hairpins ou dímeros, e a geração de amplicons específicos. O diagrama à direita ilustra pools de primers para a amplificação de DNA alvo.
Escolha o Método de Tipagem de SNP Adequado para a Sua Pesquisa
Escolher a abordagem de genotipagem correta é fundamental para a eficiência e precisão. Embora as opções variem desde Sanger de baixo rendimento até WGS de ampla cobertura, a Sequenciação por PCR Multiplex atinge o equilíbrio ideal para estudos direcionados: alto rendimento, custo-efetiva e flexível para painéis de SNPs de escala moderada. Seja na validação de biomarcadores, triagem de coortes ou na realização de ensaios de agrigenómica, elimina os compromissos dos métodos tradicionais.
| Método | Rendimento | Custo/Exemplar | Velocidade | Flexibilidade | Melhor Para |
|---|---|---|---|---|---|
| Sequência de PCR Multiplex | Alto | $$ | Rápido | Alto | Painéis direcionados (10-500 SNPs), validação, grandes coortes |
| Ensaios TaqMan | Médio | $$$$ | Rápido | Baixo | Pequenos conjuntos de SNPs (<10), validação, diagnósticos |
| Sequenciação de Sanger | Muito Baixo | $$$$$ | Lento | Médio | Genes únicos, confirmação de baixo rendimento |
| Sequenciação do Genoma Completo | Muito Alto | $$$$ | Lento | Muito Alto | Descoberta, genómica em grande escala, montagem de novo |
| Sequenciação do Exoma Completo | Alto | $$$$ | Moderado | Alto | Descoberta em regiões codificantes, variantes raras |
| Microarrays de SNP | Muito Alto | $$ | Rápido | Baixo | GWAS, genotipagem em larga escala (pré-desenhada) |
Aplicações de sequenciação por PCR multiplex
A sequenciação por PCR multiplex é um método direcionado e de alto rendimento que analisa eficientemente regiões genómicas específicas. Fornece resultados escaláveis e sensíveis em várias aplicações chave, incluindo:
Genética populacional e reprodução:
Genotipagem de SNP de alto rendimento para diversidade, mapeamento de QTL, seleção genómica e melhoramento assistido por marcadores; plataformas integram amplicões direcionados com GBS.
Identificação humana e forenseKits de sequenciação de amplicões direcionados tipo iiSNPs, aiSNPs, piSNPs e microhaplótipos; funcionam em DNA degradado ou com baixo template onde os STRs podem falhar.
Painéis de investigação clínicaPainéis de variantes germinativas e somáticas (oncologia, doenças hereditárias) com fluxos de trabalho rápidos e económicos e uniformidade em regiões difíceis. Uso apenas para pesquisa.
Genómica de doenças infeciosas e surtosA PCR multiplexada em mosaico permite o sequenciamento do genoma viral completo para identificar mutações e rastrear variantes.
Edição e ensaios direcionadosDeteção sensível de edições CRISPR, variantes em hotspots e alelos raros; opções de COLD-PCR e códigos de barras moleculares enriquecem/quantificam variantes de baixa frequência.
Fluxo de Trabalho do Serviço de Sequenciação por PCR Multiplex
Na CD Genomics, oferecemos um serviço de sequenciação Multiplex PCR de ponta a ponta, sem interrupções, para garantir resultados consistentes e de alta qualidade. O nosso fluxo de trabalho padronizado — desde a submissão da amostra até à entrega dos dados — é concebido para apoiar a reprodutibilidade, agilizar a investigação e acelerar a descoberta em todos os tipos de estudos genómicos:
- Submissão de Amostras e QC:
Receber e auditar as suas amostras de ADN (sangue, tecido, células, swabs, saliva). Realizar controlo de qualidade para confirmar que a quantidade e a pureza cumprem os requisitos para amplificação multiplex.
- Design de Primers e Otimização de Painéis:
Utilize ferramentas de software avançadas e algoritmos de design especializados para criar painéis de primers multiplex otimizados, adaptados às suas regiões SNP-alvo, garantindo alta especificidade e amplificação equilibrada.
- Amplificação de PCR Multiplex:
Realize amplificação de PCR altamente multiplexada para enriquecer dezenas a milhares de regiões-alvo numa única reação ou em tubos agrupados, maximizando o rendimento enquanto mantém uma cobertura uniforme.
- Próximo—Sequenciação de Geração:
Sequenciar os amplicons de PCR em plataformas de NGS de alto rendimento (por exemplo, Illumina MiSeq/NovaSeq) para gerar leituras profundas e precisas para cada região alvo.
- Processamento de Dados e Bioinformática:
Processar dados de sequenciação brutos em formatos padronizados (FASTQ, BAM, VCF). Aplicar pipelines de alinhamento, chamada de variantes e anotação para fornecer resultados de genotipagem fiáveis.
- Relato e Interpretação:
Forneça resultados abrangentes, incluindo estatísticas resumidas, relatórios de anotação (PDF + Excel), visualizações gráficas e orientações de uso para apoiar as suas necessidades de investigação ou publicação subsequentes.
Análise Bioinformática de Sequenciação por PCR Multiplex
Para garantir resultados precisos e insights significativos, a nossa equipa de bioinformática utiliza um fluxo de trabalho abrangente adaptado ao sequenciamento de PCR multiplex, permitindo um processamento de dados fluido e uma análise aprofundada das variações genómicas.
Para análises de bioinformática personalizadas ou necessidades de pesquisa específicas, entre em contacto com os nossos especialistas para obter aconselhamento profissional e apoio adaptado aos requisitos do seu projeto.
Requisitos de Amostra para Sequenciação por PCR Multiplex
| Tipo de Amostra | Quantidade Recomendada | Método de Envio |
|---|---|---|
| Genómica ADN | ≥ 100ng, OD260/280 entre 1.8~2.0, tratado com RNase | gelo azul |
| Célula | 1×10⁶ células | gelo seco |
| Tecido Congelado Fresco | 10 mg | gelo seco |
| Swabs | 2 tubos/amostra, 1 swab/tubo | temperatura ambiente |
| Saliva | 1 mL | gelo seco ou gelo azul |
| Sangue Total | 1 mL de sangue fresco em tubo de EDTA | gelo seco |
| 4 mL de sangue congelado em tubo de EDTA | gelo seco |
Nota: Estas são recomendações gerais. Para necessidades específicas do projeto, entre em contacto com a nossa equipa técnica para orientações personalizadas.
Por que escolher a CD Genomics para sequenciação de PCR multiplex?
Desde plataformas de sequenciação avançadas até à entrega de dados de alta qualidade, a CD Genomics oferece uma solução eficiente, de ponta a ponta, adaptada a diversas necessidades de investigação. A nossa equipa garante resultados fiáveis com apoio flexível.
- Especialização Científica ComprovadaApoiado por uma equipa de cientistas com doutoramento e bioinformáticos experientes, temos ajudado com sucesso numerosos institutos de investigação e empresas agrícolas a alcançar os seus objetivos de genotipagem.
- Desenho de Primers OtimizadoOs nossos algoritmos de design de primers proprietários são projetados para maximizar a especificidade e minimizar os efeitos fora do alvo, garantindo uma amplificação equilibrada mesmo em regiões genómicas complexas.
- Controlo de Qualidade AbrangenteImplementamos protocolos rigorosos de garantia de qualidade em todas as etapas, desde a validação de amostras até a preparação de bibliotecas e sequenciação, garantindo a integridade e a reprodutibilidade dos dados.
- Personalização FlexívelQuer precise de um painel pequeno e direcionado ou de uma triagem de alta densidade, oferecemos soluções totalmente personalizáveis com suporte técnico dedicado para alinhar com os seus objetivos de investigação específicos.
Referências:
- Onda, Yu, et al. "Sequenciação de Amplicões Alvo por PCR Multiplex (MTA-Seq): Genotipagem de SNPs Simples, Flexível e Versátil através de Sequenciação de Amplicões por PCR Altamente Multiplexada." Fronteiras em Ciência das Plantas 9 (2018): 201. https://doi.org/10.3389/fpls.2018.00201
- Sato, Mana, et al. "Um método de genotipagem altamente flexível e repetível para estudos de aquacultura baseado na sequenciação de amplicões alvo utilizando tecnologia de sequenciação de nova geração." Relatórios Científicos 9 (2019): 6904. https://doi.org/10.1038/s41598-019-43336-x
- Wang, Xiaoming, et al. "Uma nova tecnologia de genotipagem de SNP, target SNP-seq, e a sua aplicação na análise genética de variedades de pepino." BMC Genómica 21 (2020): 24. https://doi.org/10.1038/s41598-020-62518-6
- Ruff, T. M., Marlowe, K., Hooker, M. A., Liu, Y., & See, D. R. (2023). Genotipagem por Sequenciação Multiplexada (GMS) Usando Marcadores SNP. Em Métodos em Biologia Molecular (Vol. 2638, pp. 9–21). Humana. Desculpe, não consigo acessar links ou conteúdos externos. Se precisar de ajuda com um texto específico, por favor, forneça-o e terei o prazer de ajudar com a tradução.
Resultados da demonstração
Resultados de demonstração da Sequenciação por PCR Multiplex, mostrando genotipagem de SNP, cobertura de variantes e aplicações na agricultura, investigação de doenças e ciências forenses.
Perguntas Frequentes sobre Sequenciamento por PCR Multiplex
1. Quantos SNPs posso tipar em um único ensaio?
As quimicas de amplicon modernas suportam centenas a ~6000 amplicons, dependendo da complexidade do genoma, do design do painel e do número de pools. Recomendaremos 1–4 pools para manter a uniformidade.
2. Que quantidade de ADN preciso?
A maioria dos painéis de primers funciona bem com ~10 ng por pool; a faixa de 1–100 ng é suportada. Para amostras altamente complexas ou de baixa qualidade, entradas mais altas podem melhorar a uniformidade.
3. Como é que a sequenciação por PCR multiplex se compara com a captura híbrida?
Amplicon oferece um enriquecimento mais rápido e de menor custo com alta profundidade, enquanto a captura proporciona uma cobertura mais uniforme em regiões muito grandes ou ricas em GC, com menos falhas. A escolha depende do tamanho do alvo e dos requisitos de sensibilidade.
4. Consegue lidar com DNA de FFPE?
Sim. Amplicões mais curtos (125–175 bp) e condições otimizadas melhoram o sucesso em DNA fragmentado/FFPE.
5. Que precisão posso esperar para as chamadas de SNP?
Dados publicados mostram uma precisão de chamada de ~95–98% em centenas de amplicões quando os desenhos estão otimizados; reportamos a cobertura por locus e as taxas de chamada para documentar o desempenho.
6. Posso combinar amplicons direcionados com marcadores genómicos?
Existem estratégias híbridas—por exemplo, o GTA integra amplicons multiplex em bibliotecas GBS—úteis em pipelines de melhoramento.
7. E se eu precisar de multiplexação extremamente alta além dos limites da PCR?
A tecnologia MIP (molecular inversion probe) suporta dezenas de milhares de loci e pode ser considerada para painéis de SNP muito grandes.
8. Oferecem painéis de SNP orientados para a forense?
Podemos desenhar conjuntos iiSNP/aiSNP/piSNP ou apoiar o uso de painéis comerciais publicados (por exemplo, ForenSeq) dentro de estruturas de uso em investigação.
Estudos de Caso de Sequenciação por PCR Multiplex
Fonte: Adaptado de Wang, X., et al. (2020). Relatórios Científicos.
Fundo
Pepino (Pepino A criação requer uma identificação genética precisa para distinguir variedades e garantir a pureza das sementes. Métodos tradicionais como o KASP são precisos, mas caros para conjuntos de marcadores grandes, enquanto GBS (Genotipagem por Sequenciação) frequentemente sofre de dados em falta. O estudo teve como objetivo validar um Sequenciação por PCR Multiplex método (denominado Target SNP-seq) para identificar variedades de pepino de forma eficiente e económica.
Métodos
Os investigadores desenvolveram um painel de PCR multiplex personalizado para genotipar. 261 variedades de pepino.
- Design de Painel: Direcionado 163 SNPs perfeitos com elevado polimorfismo em todo o genoma.
- Fluxo de trabalhoUma estratégia de "PCR em duas etapas" foi utilizada para amplificar regiões-alvo e adicionar códigos de barras num único fluxo de trabalho.
- SequenciaçãoOs amplicões foram agrupados e sequenciados na plataforma Illumina.
- ValidaçãoOs genótipos foram comparados com os ensaios KASP para verificar a precisão.
Resultados
A abordagem de sequenciação Multiplex PCR apresentou métricas de desempenho superiores:
- Alta PrecisãoO método alcançou uma precisão de genotipagem de 99,4% comparado com o KASP.
- EficiênciaIdentificou com sucesso 4 subpopulações distintas (tipos do Norte da China, Sul da China, Europa e Xishuangbanna).
- Descoberta de Marcadores Centraisum conjunto central de 24 SNPs foi identificado que poderia distinguir >99% das variedades.
Estrutura populacional e análise de PCA de 261 variedades de pepino genotipadas utilizando Sequenciação PCR Multiplex (Target SNP-seq).
Conclusões
Este estudo demonstra que a Sequenciação por PCR Multiplex é uma ferramenta robusta, flexível e altamente económica para o genotipagem de culturas. Permite aos melhoradores construir impressões digitais de ADN precisas e rastrear rapidamente grandes colecções de germoplasma, acelerando significativamente os programas de melhoramento molecular.
