Diretrizes para Submissão de Amostras
O que é Sequenciação por PCR Multiplex?
A sequenciação por PCR multiplex da CD Genomics combina a reação em cadeia da polimerase (PCR) multiplex com sequenciação de nova geração (NGS). Utiliza múltiplos pares de primers em um único tubo de reação para amplificar simultaneamente várias regiões genómicas específicas (contendo SNPs-alvo). Os amplicons agrupados são então sequenciados em plataformas NGS de alto rendimento (como Illumina MiSeq/NovaSeq), permitindo a genotipagem paralela de centenas de SNPs em muitas amostras. Este método é altamente específico, sensível e eficiente para estudos focados.
Utilizamos o nosso software proprietário AIdesign e MFEprimer para o design de primers multiplex e controlo de qualidade, desenvolvido com a orientação de especialistas reconhecidos internacionalmente. Esta solução de ponta fornece primers específicos para todo o genoma com base em algoritmos de estabilidade termodinâmica, adaptados para atender às suas necessidades de pesquisa. Com a capacidade de multiplexar até 5.000 reações em um único tubo e requisitos de entrada tão baixos quanto 100 pg de gDNA, este método enriquece rapidamente e de forma eficiente as regiões-alvo para um sequenciamento preciso. Oferecemos dois formatos de design flexíveis—tubo único ou múltiplos tubos—com base no tipo da sua região-alvo.
Desenho de primers e fluxo de trabalho de PCR multiplex. O fluxograma descreve o processo de seleção e otimização de primers para a amplificação por PCR, garantindo que não haja hairpins ou dímeros, e a geração de amplicons específicos. O diagrama à direita ilustra pools de primers para a amplificação de DNA alvo.
Escolha o Método de Tipagem de SNP Adequado para a Sua Pesquisa
Escolher a abordagem de genotipagem certa é crucial para a eficiência e precisão. Embora as opções variem desde Sanger de baixo rendimento até WGS de ampla cobertura, a Sequenciação por PCR Multiplex encontra o equilíbrio ideal para estudos direcionados: alta capacidade de rendimento, custo-efetiva e flexível para painéis de SNPs de escala moderada. Seja para validar biomarcadores, rastrear coortes ou realizar ensaios de agrigenómica, elimina as desvantagens dos métodos tradicionais.
| Método | Rendimento | Custo/Sample | Velocidade | Flexibilidade | Melhor Para |
|---|---|---|---|---|---|
| Sequência de PCR Multiplex | Alto | $$ | Rápido | Alto | Painéis direcionados (10-500 SNPs), validação, grandes coortes |
| Ensaios TaqMan | Médio | $$$$ | Rápido | Baixo | Pequenos conjuntos de SNPs (<10), validação, diagnósticos |
| Sequenciação de Sanger | Muito Baixo | $$$$$ | Lento | Médio | Genes únicos, confirmação de baixo rendimento |
| Sequenciação do Genoma Completo | Muito Alto | $$$$ | Lento | Muito Alto | Descoberta, genómica em larga escala, montagem de novo |
| Sequenciação do Exoma Completo | Alto | $$$$ | Moderado | Alto | Descoberta em regiões codificantes, variantes raras |
| Microarranjos SNP | Muito Alto | $$ | Rápido | Baixo | GWAS, genotipagem em larga escala (pré-desenhada) |
Aplicações de sequenciação por PCR multiplex
A sequenciação por PCR multiplex é um método direcionado e de alta capacidade que analisa de forma eficiente regiões genómicas específicas. Fornece resultados escaláveis e sensíveis em várias aplicações-chave, incluindo:
Genética populacional e reprodução:
Genotipagem de SNP de alto rendimento para diversidade, mapeamento de QTL, seleção genómica e melhoramento assistido por marcadores; plataformas integram amplicões direcionados com GBS.
Identificação humana e forensicologiaKits de sequenciação de amplicões direcionados tipo iiSNPs, aiSNPs, piSNPs e microhaplótipos; funcionam em DNA degradado ou com baixo template onde os STRs podem falhar.
Painéis de pesquisa clínicaPainéis de variantes germinativas e somáticas (oncologia, doenças hereditárias) com fluxos de trabalho rápidos e económicos e uniformidade em regiões difíceis. Uso apenas para investigação.
Genómica de doenças infeciosas e surtosA PCR multiplex em mosaico permite o sequenciamento do genoma viral completo para identificar mutações e rastrear variantes.
Edição e ensaios direcionadosDeteção sensível de edições CRISPR, variantes de hotspot e alelos raros; opções de COLD-PCR e códigos de barras moleculares enriquecem/quantificam variantes de baixa frequência.
Fluxo de Trabalho do Serviço de Sequenciação por PCR Multiplex
Na CD Genomics, oferecemos um serviço de sequenciação Multiplex PCR de ponta a ponta, sem interrupções, para garantir resultados consistentes e de alta qualidade. O nosso fluxo de trabalho padronizado—desde a submissão da amostra até à entrega dos dados—é concebido para apoiar a reprodutibilidade, otimizar a investigação e acelerar a descoberta em todos os tipos de estudos genómicos:
- Submissão de Amostras e QC:
Receber e auditar as suas amostras de DNA (sangue, tecido, células, swabs, saliva). Realizar controlo de qualidade para confirmar que a quantidade e a pureza cumprem os requisitos para amplificação multiplex.
- Design de Primers e Otimização de Painéis:
Utilize ferramentas de software avançadas e algoritmos de design especializados para criar painéis de primers multiplex otimizados, adaptados às suas regiões SNP-alvo, garantindo alta especificidade e amplificação equilibrada.
- Amplificação de PCR Multiplex:
Realize amplificação PCR altamente multiplexada para enriquecer dezenas a milhares de regiões-alvo numa única reação ou em tubos agrupados, maximizando o rendimento enquanto mantém uma cobertura uniforme.
- Próximo—Sequenciação de Geração:
Sequencie os amplicons de PCR em plataformas de NGS de alta capacidade (por exemplo, Illumina MiSeq/NovaSeq) para gerar leituras profundas e precisas para cada região-alvo.
- Processamento de Dados e Bioinformática:
Processar dados de sequenciação bruta em formatos padronizados (FASTQ, BAM, VCF). Aplicar pipelines de alinhamento, chamada de variantes e anotação para fornecer resultados de genotipagem fiáveis.
- Relato e Interpretação:
Forneça saídas abrangentes, incluindo estatísticas resumidas, relatórios de anotação (PDF + Excel), visualizações gráficas e orientações de uso para apoiar as suas necessidades de investigação ou publicação subsequentes.
Análise Bioinformática de Sequenciamento por PCR Multiplex
Para garantir resultados precisos e insights significativos, a nossa equipa de bioinformática utiliza um fluxo de trabalho abrangente adaptado ao sequenciamento de PCR multiplex, permitindo um processamento de dados fluido e uma análise aprofundada das variações genómicas.
Para análises de bioinformática personalizadas ou necessidades de pesquisa específicas, entre em contacto com os nossos especialistas para obter aconselhamento profissional e apoio adaptado aos requisitos do seu projeto.
Requisitos de Amostra para Sequenciação por PCR Multiplex
| Tipo de Amostra | Quantidade Recomendada | Método de Envio |
|---|---|---|
| Genómica ADN | ≥ 100ng, OD260/280 entre 1.8~2.0, tratado com RNase | gelo azul |
| Célula | 1×10⁶ células | gelo seco |
| Tecido Fresco Congelado | 10 mg | gelo seco |
| Swabs | 2 tubos/amostra, 1 swab/tubo | temperatura ambiente |
| Saliva | 1 mL | gelo seco ou gelo azul |
| Sangue Total | 1 mL de sangue fresco em tubo de EDTA | gelo seco |
| 4 mL de sangue congelado em tubo de EDTA | gelo seco |
Nota: Estas são recomendações gerais. Para necessidades específicas do projeto, entre em contacto com a nossa equipa técnica para orientações personalizadas.
Por que escolher a CD Genomics para sequenciação de PCR multiplex?
Desde plataformas de sequenciação avançadas até à entrega de dados de alta qualidade, a CD Genomics oferece uma solução eficiente, de ponta a ponta, adaptada a diversas necessidades de investigação. A nossa equipa garante resultados fiáveis com suporte flexível.
- Especialização Científica ComprovadaApoiado por uma equipa de cientistas com doutoramento e bioinformáticos experientes, temos ajudado com sucesso numerosos institutos de investigação e empresas agrícolas a alcançar os seus objetivos de genotipagem.
- Desenho de Primers OtimizadoOs nossos algoritmos de design de primers proprietários são concebidos para maximizar a especificidade e minimizar os efeitos fora do alvo, garantindo uma amplificação equilibrada mesmo em regiões genómicas complexas.
- Controlo de Qualidade AbrangenteImplementamos protocolos rigorosos de garantia de qualidade em todas as etapas, desde a validação de amostras até a preparação de bibliotecas e sequenciação, garantindo a integridade e a reprodutibilidade dos dados.
- Personalização FlexívelSeja para um painel pequeno e direcionado ou para triagens de alta densidade, oferecemos soluções totalmente personalizáveis com suporte técnico dedicado para alinhar com os seus objetivos de pesquisa específicos.
Referências:
- Onda, Yu, et al. "Sequenciação de Amplicões Alvo por PCR Multiplex (MTA-Seq): Genotipagem de SNPs Simples, Flexível e Versátil através de Sequenciação de Amplicões PCR Altamente Multiplexada." Fronteiras em Ciência das Plantas 9 (2018): 201. https://doi.org/10.3389/fpls.2018.00201
- Sato, Mana, et al. "Um método de genotipagem altamente flexível e repetível para estudos de aquacultura baseado em sequenciação de amplicões alvo utilizando tecnologia de sequenciação de nova geração." Relatórios Científicos 9 (2019): 6904. https://doi.org/10.1038/s41598-019-43336-x
- Wang, Xiaoming, et al. "Uma nova tecnologia de genotipagem de SNP, target SNP-seq, e a sua aplicação na análise genética de variedades de pepino." BMC Genómica 21 (2020): 24. https://doi.org/10.1038/s41598-020-62518-6
- Ruff, T. M., Marlowe, K., Hooker, M. A., Liu, Y., & See, D. R. (2023). Genotipagem por Sequenciação Multiplexada (GMS) Usando Marcadores SNP. Em Métodos em Biologia Molecular (Vol. 2638, pp. 9–21). Humana. Desculpe, não posso acessar links ou conteúdos externos. Se precisar de ajuda com um texto específico, por favor, cole-o aqui e eu ajudarei com a tradução.
Resultados da demonstração
Resultados de demonstração da Sequenciação por PCR Multiplex, mostrando genotipagem de SNP, cobertura de variantes e aplicações na agricultura, investigação de doenças e forense.
Perguntas Frequentes
1. Quantos SNPs posso tipar em um único ensaio?
As quimicas de amplicon modernas suportam centenas a ~6000 amplicons, dependendo da complexidade do genoma, do design do painel e do número de pools. Recomendaremos 1–4 pools para manter a uniformidade.
2. Que quantidade de ADN preciso?
A maioria dos painéis de primers funciona bem com ~10 ng por pool; a faixa de 1–100 ng é suportada. Para amostras altamente complexas ou de baixa qualidade, entradas mais elevadas podem melhorar a uniformidade.
3. Como é que a sequenciação por PCR em multiplex se compara com a captura híbrida?
A Amplicon oferece uma enriquecimento mais rápido e de menor custo com alta profundidade, enquanto a captura proporciona uma cobertura mais uniforme em regiões muito grandes ou ricas em GC, com menos falhas. A escolha depende do tamanho do alvo e dos requisitos de sensibilidade.
4. Conseguem lidar com DNA de FFPE?
Sim. Amplicões mais curtos (125–175 bp) e condições otimizadas melhoram o sucesso em DNA fragmentado/FFPE.
5. Que precisão posso esperar para as chamadas de SNP?
Dados publicados mostram uma precisão de chamada de ~95–98% em centenas de amplicons quando os desenhos são otimizados; reportamos a cobertura e as taxas de chamada por locus para documentar o desempenho.
6. Posso combinar amplicões direcionados com marcadores de genoma amplo?
Existem estratégias híbridas—por exemplo, o GTA integra amplicons multiplex em bibliotecas GBS—úteis em pipelines de melhoramento.
7. E se eu precisar de uma multiplexação extremamente alta além dos limites da PCR?
A tecnologia MIP (prova de inversão molecular) suporta dezenas de milhares de loci e pode ser considerada para painéis de SNP muito grandes.
8. Oferecem painéis de SNP orientados para a forensic?
Podemos desenhar conjuntos iiSNP/aiSNP/piSNP ou apoiar o uso de painéis comerciais publicados (por exemplo, ForenSeq) dentro de estruturas de uso em investigação.
Estudo de Caso: Genotipagem de Alto Rendimento de Variedades de Pepino através de Sequenciação por PCR Multiplex
Fonte: Adaptado de Wang, X., et al. (2020). Relatórios Científicos.
Fundo
Pepino (Pepino A criação requer uma identificação genética precisa para distinguir variedades e garantir a pureza das sementes. Métodos tradicionais como KASP são precisos, mas caros para conjuntos de marcadores grandes, enquanto GBS (Genotipagem por Sequenciação) frequentemente sofre de dados em falta. O estudo teve como objetivo validar um Sequenciação por PCR Multiplex método (denominado Target SNP-seq) para identificar variedades de pepino de forma eficiente e económica.
Métodos
Os investigadores conceberam um painel de PCR multiplex personalizado para genotipar. 261 variedades de pepino.
- Design de Painéis: Direcionado 163 SNPs perfeitos com elevado polimorfismo em todo o genoma.
- Fluxo de trabalhoUma estratégia de "PCR em duas etapas" foi utilizada para amplificar regiões-alvo e adicionar códigos de barras em um único fluxo de trabalho.
- SequenciaçãoOs amplicões foram agrupados e sequenciados na plataforma Illumina.
- ValidaçãoOs genótipos foram comparados com os ensaios KASP para verificar a precisão.
Resultados
A abordagem de sequenciação Multiplex PCR apresentou métricas de desempenho superiores:
- Alta PrecisãoO método alcançou uma precisão de genotipagem de 99,4% comparado com o KASP.
- EficiênciaIdentificou com sucesso 4 subpopulações distintas (tipos do Norte da China, Sul da China, Europa e Xishuangbanna).
- Descoberta de Marcadores Centraisum conjunto fundamental de 24 SNPs foi identificado que poderia distinguir >99% das variedades.
Estrutura populacional e análise de PCA de 261 variedades de pepino genotipadas utilizando Sequenciação PCR Multiplex (Target SNP-seq).
Conclusões
Este estudo demonstra que a Sequenciação por PCR Multiplex é uma ferramenta robusta, flexível e altamente económica para a genotipagem de culturas. Permite aos melhoradores construir impressões digitais de ADN precisas e rastrear rapidamente grandes coleções de germoplasma, acelerando significativamente os programas de melhoramento molecular.
