Serviço DAP-Seq (sequenciação por purificação de afinidade de DNA)

A CD Genomics oferece serviços de DAP-seq utilizando tecnologias genómicas avançadas para analisar a ligação de fatores de transcrição. A nossa abordagem de alto rendimento identifica interacções TF-DNA, proporcionando insights sobre redes regulatórias de genes em várias áreas de investigação. Este serviço é ideal para desvendar os mecanismos de expressão génica tanto em plantas como em animais, facilitando avanços na investigação biológica.

A Introdução do DAP-Seq

A identificação abrangente de TFBS (locais de ligação de fatores de transcrição) em todo o genoma é essencial para caracterizar elementos regulatórios e a função dos fatores de transcrição. ChIP-Seq A (sequenciação por imunoprecipitação de cromatina) é uma abordagem poderosa para determinar em vivo os locais de ligação de fatores de transcrição (TFBS). No entanto, o método é limitado em escala, pois depende de anticorpos específicos para cada fator de transcrição, o que pode ser tecnicamente desafiador e caro. Atualmente, métodos alternativos como o DAP-Seq podem oferecer uma abordagem simples e de alto rendimento para examinar a ligação de TF ao seu alvo cognato (gDNA) em um contexto livre de cromatina, mantendo informações importantes relacionadas à sequência do genoma primário e à metilação do DNA. O método não requer anticorpos específicos ou primers específicos de genes, sendo adequado para todos os eucariotos, tornando-se uma ferramenta poderosa para entender elementos regulatórios e a função dos TF.

O nome completo de DAP-seq significa sequenciação por purificação de afinidade de DNA. Esta técnica envolve a identificação de locais de ligação de fatores de transcrição (TFBS) através da expressão in vitro de fatores de transcrição, sem estar limitada por anticorpos ou espécies, e possui vantagens de alta capacidade de processamento. Desde a sua criação, esta tecnologia tem sido amplamente aplicada no estudo da regulação transcricional e epigenómica.

Princípio do Experimento DAP-seq:

Nos experimentos de DAP-seq, a proteína expressa externamente e o DNA são submetidos a purificação por afinidade, seguida de sequenciação de alto rendimento do DNA que se ligou à proteína. O processo fundamental envolve a construção da sequência codificadora (CDS) do fator de transcrição num vetor contendo uma etiqueta de afinidade, criando um vetor de expressão de proteína e realizando a expressão de proteína in vitro para produzir uma proteína de fusão do fator de transcrição e da etiqueta de afinidade. Subsequentemente, o DNA genómico da amostra é extraído, uma biblioteca de DNA é construída e o fator de transcrição expresso in vitro com a etiqueta de afinidade é combinado com a biblioteca de DNA. O DNA ligado é então eluído e sujeito a sequenciação.

Comparação entre DAP-seq e ChIP-seq Tecnologias

Vantagens do DAP-Seq

• Adequado para o processamento de amostras em alto rendimento de colecções inteiras de clones ORF de TF.
• Não requer os anticorpos específicos para cada fator de transcrição, é relativamente rentável e adequado para todos os eucariotos.
• O DAP-Seq retém muitas das modificações e características secundárias específicas de tecidos/células presentes em todo o genoma.
• O processo de enriquecimento de fragmentos de DNA em locais de ligação de TF é mais simples.

Aplicações do DAP-Seq

• Análise e caracterização funcional de locais de ligação de fatores de transcrição
• Identificação de tipos de modificação de histonas em loci específicos de DNA
• Estudo sobre a correlação entre modificações de histonas e expressão génica.

Fluxo de Trabalho DAP-Seq

A nossa equipa de especialistas altamente experientes executa a gestão de qualidade seguindo cada procedimento para garantir resultados abrangentes e precisos. O nosso fluxo de trabalho DAP-Seq está descrito abaixo, incluindo preparação de bibliotecas, expressão de proteínas, purificação por afinidade de DNA, sequenciação e análise bioinformática.

Fig. 1. Procedimento Experimental do DAP-seq. (Anna Bartlett et al., 2017)

Especificações do Serviço

	Requisitos de Amostra TF≥ 5 µg, Quantidade Mínima: 1 µg, Concentração≥20 ng/µL Célula ≥ 5 x106 Tecido ≥ 500 mg, Quantidade Mínima: 200 mg Nota: Os montantes de amostra são listados apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.
Clique	Estratégia de Sequenciamento Plataforma Illumina Hiseq/NovaSeq Faixa de tamanho de inserto de ~200 bp para preparação de bibliotecas de DNA ≥20 M leituras limpas
	Análise Bioinformática Fornecemos múltiplas análises de bioinformática personalizadas: Controlo de qualidade de dados Alinhamento ao genoma de referência com estatísticas de mapeamento Chamada e anotação de picos Anotação de picos diferenciais Análise funcional de genes associados a picos Previsão de motivos Análise de vias Resultados de visualização Nota: Os dados recomendados e os conteúdos de análise apresentados são apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes em DAP-Seq para a sua escrita (personalização)

Na CD Genomics, fornecemos sequenciação de alta qualidade e uma análise bioinformática abrangente para o seu projeto DAP-Seq, permitindo a identificação de TFBS (locais de ligação de fatores de transcrição) em todo o genoma. Se tiver requisitos adicionais ou perguntas, não hesite em contactar-nos.

Referências

1. Ronan C. O'Malley, S. shan C. Huang, L. Song, et al. As características do cistrome e epicistrome moldam a paisagem regulatória do DNA, Célula165 (2016) 1280–1292.
2. Anna Bartlett, Ronan C. O'Malley, S. shan C. Huang, et al. Mapeamento de locais de ligação de fatores de transcrição em todo o genoma usando DAP-Seq, Protocolos da Natureza, 12 (2017) 1659–1672.

Os resultados parciais estão apresentados abaixo:

1. Como é que o DAP-seq simplifica o enriquecimento de locais de ligação de TF?

O DAP-seq simplifica o enriquecimento ao marcar os TFs com uma Halo-tag e usar esferas magnéticas revestidas com ligandos específicos para a tag. Esta estratégia de captura magnética substitui a imunoprecipitação tradicional, reduzindo a complexidade experimental.

2. O DAP-seq pode detectar locais de ligação de ADN de fatores regulatórios?

Alguns fatores regulatórios ligam-se ao DNA indiretamente através de fatores de transcrição, e o DAP-seq só pode detectar locais de ligação de fatores de transcrição que se ligam diretamente ao DNA. Portanto, não é recomendável usar o DAP-seq para detectar locais de ligação de fatores regulatórios que se ligam ao DNA indiretamente.

3. Existem limitações ao DAP-seq?

Apesar das suas vantagens, o DAP-seq baseia-se na expressão de proteínas in vitro, o que pode introduzir algumas diferenças em comparação com experimentos totalmente in vivo.

4. Como é que o DAP-seq difere dos experimentos in vivo?

As condições in vitro podem não suportar o correto dobramento de proteínas ou a formação de complexos necessários para a ligação TF-DNA, afetando a funcionalidade de alguns TFs.

Uma rede regulatória transcricional de brassinosteroides participa na regulação da elongação das fibras no algodão.

Jornal: Fisiologia Vegetal

Fator de impacto: 7,479

Publicado: 21 de dezembro de 2022

Fundo

Os brassinosteróides (BRs) são substâncias essenciais encontradas na colza, regulando vários processos de desenvolvimento e fisiológicos em todo o reino vegetal. A deficiência ou insensibilidade aos BRs leva a mudanças morfológicas significativas. No algodão, os BRs desempenham um papel crucial na elongação das fibras, afetando a expressão génica relacionada com a biossíntese da parede celular e a dinâmica do citoesqueleto. O fator de transcrição GhBES1.4 regula positivamente a elongação das fibras de algodão ao ligar-se a genes-alvo específicos, conforme identificado através de DAP-seq e RNA-seq análises.

Materiais e Métodos

Resultados

Neste estudo, os autores utilizaram DAP-seq para identificar 9.894 regiões de ligação de alta confiança do GhBES1.4 no algodão, predominantemente localizadas perto dos locais de início de transcrição. Caracterizaram ainda os motivos de ligação do GhBES1.4, revelando uma preferência por elementos E-box e também ligação a BRRE e novos motivos (MEME-3/4/5). Ensaios de levedura de um híbrido e BLI confirmaram a afinidade do GhBES1.4 por esses motivos, destacando o seu papel na regulação da expressão génica, incluindo GhCPD, GhCYP90D1 e GhBRL, cruciais para o desenvolvimento da fibra de algodão.

Figura 1 Identificação dos genes-alvo diretos de GhBES1.4 usando DAP-seq.

Figura 2 Caracterização do local-alvo para GhBES1.4.

Os autores geraram plantas de algodão transgénicas GhBES1.4-OE e RNAi, constatando que GhBES1.4 regula positivamente a elongação das fibras. As plantas GhBES1.4-OE apresentaram um aumento no comprimento das fibras e uma regulação negativa de genes relacionados aos BR, enquanto as plantas RNAi exibiram o oposto. A análise de RNA-seq revelou 1.788 DEGs em GhBES1.4-OE e 1.566 em plantas RNAi, envolvendo genes relacionados à elongação da parede celular, síntese da parede primária e montagem de tubulina, indicando o papel de GhBES1.4 na regulação da expressão de genes relacionados à elongação das fibras.

Figura 3 A integração de DAP-seq, RNA-seq e estudo de associação genómica (GWAS) identifica os genes-alvo para GhBES1.4 regular a elongação da fibra.

Este estudo integrou DAP-seq, RNA-seq e GWAS para identificar genes-alvo de GhBES1.4 que regulam a elongação da fibra de algodão. O GWAS identificou 390 genes com loci SNP, dos quais 35 estavam altamente associados ao comprimento da fibra (FL). A análise do transcriptoma e a qPCR validaram a expressão diferencial de 7 genes em materiais transgénicos. Ensaios de interferência de biofilme confirmaram a ligação de GhBES1.4 aos promotores de genes candidatos, e ensaios de atividade LUC mostraram ativação direta por GhBES1.4. Estes genes, incluindo RVE5, HMG1 e CYP84A1, influenciam o desenvolvimento da fibra através de vias como a elongação celular e a síntese da parede celular. O silenciamento de GhCYP84A1 e GhHMG1 encurtou significativamente o comprimento da fibra, destacando a sua importância na regulação mediada por GhBES1.4 da elongação da fibra de algodão.

Figura 4 Mecanismo de elongação de fibras mediado por GhBES1.4.

Conclusão

Este estudo demonstra a eficácia do DAP-seq na identificação de genes-alvo de GhBES1.4 no algodão, revelando 1.531 potenciais alvos. Esta abordagem oferece um método rápido e robusto para desvendar redes regulatórias mediadas por TF em plantas como o algodão.

Referência

1. Liu L, Chen G, Li S, et al. Uma rede regulatória transcricional de brassinosteróides participa na regulação da elongação das fibras no algodão. Fisiologia Vegetal. 2023, 191(3):1985-2000.