Sequenciação Degradómica

A CD Genomics agora é capaz de fornecer o serviço de sequenciação de degradoma para facilitar uma compreensão mais abrangente do panorama de microRNA em plantas. Ao utilizar o nosso serviço, pode detetar os alvos de mRNA do microRNA de forma altamente sensível e precisa.

A Introdução do Sequenciamento Degradoma

Os microRNAs (miRNAs) são uma classe de RNAs não codificantes endógenos com 20-24 nucleotídeos (nt) de comprimento, produzidos por excisão altamente precisa de precursores em forma de laço. Os microRNAs são reguladores importantes da expressão génica nos níveis transcricional e pós-transcricional. O miRNA maduro é recrutado para um complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) para degradar alvos de mRNA e suprimir a sua tradução. Os miRNAs são altamente conservados entre espécies com base em comparações entre diferentes espécies. Existem também miRNAs não conservados e específicos de espécies nas plantas. Os miRNAs não conservados são frequentemente expressos em níveis baixos e, portanto, muitos não são identificados em projetos de sequenciação em pequena escala. Sequenciação de RNA pequeno a tecnologia permitiu a identificação de miARNs de baixa abundância.

A técnica de RACE 5' modificada (amplificação rápida das extremidades de cDNA) foi amplamente utilizada para confirmação de alvos e mapeamento de locais de clivagem. No entanto, esta abordagem é trabalhosa, demorada, dispendiosa e apenas aplicável a investigações de escala reduzida. Recentemente, a sequenciação de Degradome, também conhecida como análise paralela das extremidades de RNA (PARE), surgiu como um método poderoso que combina ambos. sequenciação de alto rendimento e modificou o 5' RACE para rastrear miRNA e ta-siRNA (transporte-acting siRNA) alvos em grande escala. Neste método, o mRNA degradado é ligado a adaptadores e transcrito reversamente. Os fragmentos são então digeridos com Mmel, purificados, ligados a adaptadores 3'- e amplificados por PCR. O sequenciamento profundo do cDNA e a análise do degradoma fornecem informações abrangentes sobre transcritos não capados que sofrem degradação em plantas.

Vantagens da Sequenciação Degradoma

• Identificação de miARNs conhecidos e novos e ta-siARNs
• Identificação de alvos de miRNA e redes regulatórias
• Resumo estatístico dos locais de degradação de mRNA
• Explora novos biomarcadores e redes regulatórias de circRNAs.
• Alta capacidade e alta resolução

Fluxo de Trabalho de Sequenciamento de Degradoma

O fluxo de trabalho geral para sequenciação de degradoma é descrito abaixo. Para construir a biblioteca de sequenciação de degradoma, o primeiro passo é ligar amostras de RNA poliA a um adaptador de RNA contendo um sítio 3'Mme I, e transcrever. Após a síntese da segunda fita, digestão com Mme I, purificação em gel e amplificação por PCR, o adaptador 3' é ligado para sequenciação profunda. A nossa equipa de especialistas altamente experientes executa a gestão de qualidade, seguindo cada procedimento para garantir resultados confiáveis e imparciais.

Especificações de Serviço

	Requisitos de Amostra Tipo de amostra: RNA total sem degradação ou contaminação por DNA RNA total ≥ 20 μg, Quantidade Mínima: 15 μg, Concentração ≥ 100 ng/µL Relação OD A260/A280 ≥ 1,8, relação A260/230 ≥ 1,8, RIN ≥ 6 Todas as amostras de RNA total devem estar isentas de DNA. O RNA deve ser armazenado em água livre de nucleases ou RNA Stable. Nota: As quantidades de amostra são indicadas apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.
Clique	Estratégia de Sequenciamento Preparação de biblioteca Degradome Illumina HiSeq SE50 Mais de 80% das bases com uma pontuação de qualidade ≥Q30
	Análise Bioinformática Fornecemos várias análises de bioinformática personalizadas: Controlo de qualidade de dados brutos Mapeamento baseado em referência Identificação de RNAs não codificantes conhecidos e novos Análise da distribuição de fragmentos de degradação na região selecionada do genoma Identificação de mRNAs alvo Resumo estatístico do local de degradação de mRNA Análise GO/KEGG Nota: Os dados recomendados e os conteúdos de análise exibidos são apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes na Sequenciação Degradómica para a sua escrita (personalização)

Apoiado pelos nossos cientistas experientes e tecnologia avançada, a CD Genomics pode ajudá-lo a identificar alvos de RNA pequeno com resolução de base única de uma só vez através do sequenciação de alto rendimento por um rigoroso controlo de qualidade e análises avançadas de bioinformática. Se tiver requisitos adicionais ou perguntas, não hesite em contactar-nos.

Resultados da Demonstração

Os resultados parciais estão mostrados abaixo:

Distribuição da qualidade de sequenciamento

Distribuição A/T/G/C

Interface do Navegador IGV

Análise de Correlação Entre Amostras

Gráfico de Pontuação PCA

Diagrama de Venn

Gráfico de Volcano

Resultados Estatísticos da Anotação GO

Classificação KEGG

Perguntas Frequentes sobre Degradome Seq

1. Qual é o princípio da sequenciação de degradoma?

Em animais, acredita-se que a repressão de proteínas ocorra por inibição da tradução juntamente com a degradação do mRNA. Em plantas, os miARNs degradam os seus alvos de mRNA por clivagem precisa entre o 10º e o 11º nucleótido a partir da extremidade 5' do miARN na região complementar do transcrito alvo, gerando um pico distinto de etiqueta de sequência de degradoma no local de clivagem previsto em relação a outras regiões do transcrito. Com base neste princípio, o sequenciamento de degradoma é utilizado principalmente para identificar globalmente os remanescentes da clivagem dirigida por pequenos RNAs, sequenciando as extremidades 5' de RNAs não capados em plantas.

2. Quais são as vantagens do sequenciamento de degradoma para a identificação de alvos de miRNA?

Tabela 1. A comparação entre sequenciação de degradoma e métodos tradicionais para a previsão de alvos de miRNA.

3. Como é que o sequenciamento de degradoma é diferente de outros métodos de sequenciamento de RNA?

A sequenciação de degradoma foca especificamente nos produtos de degradação do RNA, enquanto outros métodos de sequenciação de RNA, como RNA-Seq tipicamente analisam todo o transcriptoma. Isso torna o sequenciamento de degradoma especialmente adequado para estudar eventos de clivagem de RNA mediadas por miRNA/siRNA.

Referência

1. Riffo-Campos, Á.L., et al.Ferramentas para previsão de alvos de miRNA baseadas em sequência: O que escolher? Revista Internacional de Ciências Moleculares, 2016, 17(12): 1987.

Estudos de Caso de Degradoma Seq

O sequenciamento de pequenos RNAs e do degradoma revela uma função importante da microRNA em Astrágalo chrysochlorus resposta a estímulos de selénio

Jornal: Jornal de Biotecnologia Vegetal
Fator de impacto: 6,305
Publicado: 21 de Maio de 2015

Resumo

Astrágalo as espécies são conhecidas como hiperacumuladoras de Se ao convertê-lo em compostos não aminoácidos. Mas não temos ideia sobre a hiperacumulação relacionada ao metabolismo do Se. Os autores tentaram entender se os miARNs desempenham um papel na acumulação de Se em plantas. Neste estudo, identificaram 418 miARNs conhecidos e 151 miARNs novos induzidos pela exposição ao Se em Astrágalo chrysochlorusAtravés da sequenciação profunda do degradoma, os autores revelaram uma função importante dos miARN em A. chrysochlorus resposta a estímulos de selénio.

Materiais e Métodos

Resultados

1. Identificação de miRNA e perfis de expressão.

Um total de 418 miRNAs conhecidos e 151 miRNAs novos foi identificado. A distribuição de miRNAs entre o controlo e o tratamento com Se é representada na figura 1. Os 418 miRNAs pertencem a 380 famílias de miRNAs, e 160 famílias de miRNAs apresentaram expressão diferente entre as amostras de controlo e tratadas com Se. 30 miRNAs novos apresentaram expressão diferente após o tratamento com Se.

Figura 1. Distribuição de miRNAs entre o controlo e o tratamento com Se: (a) miRNAs conservados; (b) miRNAs novos.

Figura 2. Perfis de expressão de pequenos RNAs do calo de controlo e tratado com Se de A. chrysochlorus.

Figura 3. Perfis de expressão de miARNs selecionados aleatoriamente com diferentes abundâncias em tratamento com Se. A. chrysochlorus calli. Um total de 1339 locais previstos foi identificado e determinado como sendo clivados por 499 miARNs. Os genes-alvo foram anotados e classificados como fatores de transcrição e suas subunidades, genes codificadores de enzimas, proteínas de resistência, repetições ricas em leucina, fechos de leucina, proteínas de dedo de zinco e outras proteínas estruturais e funcionais.

Figura 4. Gráficos de alvo (t-plots) de miARNs e os seus alvos. As setas vermelhas indicam os picos ou locais de clivagem mais abundantes. (a) miR162-3p a direcionar a proteína homóloga à endonuclease Dicer-1; (b) miR1513a a direcionar a quinase de histidina ativada por luz azul; (c) miR2118b a direcionar a proteína homóloga à hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase; (d) miR172c a direcionar a proteína homóloga ao fator de transcrição responsivo ao etileno RAP-2-7; (e) miR159b-3p a direcionar a proteína hipotética 11M9.5; (f) miR166 h-3p a direcionar a proteína de fecho de leucina do homeobox ATHB-15.

3. Análises de vias GO e KEGG

Os alvos dos miARNs identificados foram submetidos a análises de GO e KEGG para perceber os seus papéis biológicos. Os genes-alvo estão envolvidos em 47 tipos de componentes celulares, 103 tipos de funções moleculares e 144 tipos de processos biológicos.

Figura 5. Classificações GO dos alvos de miRNA em A. chrysochlorus.

Figura 6. Via de interação planta-patógeno do KEGG e miARNs novos e conhecidos obtidos neste estudo que possivelmente visam os genes envolvidos nesta via.

Referência

1. Cakir O, Candar-Cakir B, Zhang B. O sequenciamento de pequenos RNAs e degradomas revela uma função importante dos microRNAs em Astrágalo chrysochlorus resposta a estímulos de selénio. Jornal de Biotecnologia Vegetal, 2016, 14(2): 543-556.