Sequenciação Metagenómica de Longa Leitura

A CD Genomics otimizou ainda mais o processo para superar os padrões da PacBio em termos de produção e comprimento de leitura, a fim de apoiar o sequenciamento metagenómico de longas leituras, reduzir alguns erros de splicing e melhorar efetivamente a resolução do perfil da comunidade microbiana.

A Introdução do Sequenciamento Metagenómico de Longas Leituras

Metagenómica é definido como a análise genética direta de genomas contidos dentro de uma amostra ambiental. O campo começou inicialmente com a clonagem de DNA ambiental, seguida pela triagem de expressão funcional, e foi rapidamente complementado pelo sequenciamento de DNA ambiental. As amostras microbianas vêm de quase todos os lugares. Exemplos incluem microambientes dentro e sobre o corpo humano em estados saudáveis e doentes, amostras de solo, raízes de plantas, ambientes marinhos, estações de tratamento de águas residuais, áreas urbanas, e assim por diante.

Em experiências metagenómicas, o DNA genómico total isolado do ambiente é sequenciado. Isso permite ao investigador identificar os genes presentes e os processos metabólicos realizados por essas comunidades microbianas, incluindo organismos não cultiváveis no ambiente.

Enquanto muitos microrganismos naturais não podem ser isolados, cultivados ou clonados, alguma biodiversidade microbiana foi perdida na preparação de amostras e sequenciação. Agora, a CD Genomics oferece um serviço de sequenciação metagenómica de leitura longa no Sistema PacBio SMRT de forma livre de cultura, que pode sequenciar milhares de organismos em paralelo, reduzindo alguns erros de emenda e melhorando efetivamente a resolução da identificação da comunidade microbiana. A sequenciação metagenómica de leitura longa também ajuda os investigadores a gerar novas percepções sobre as funções e os caminhos do microbioma, tentando entender e elucidar as relações entre micróbios e o seu habitat/anfitrião.

A análise de dados é baseada nas leituras de CCS de moléculas únicas da mais alta qualidade, sem necessidade de montagem para classificação a nível de espécie, insights funcionais e estudo de enriquecimento de vias, podendo restaurar a informação da comunidade microbiana no ambiente. O sequenciamento metagenómico de longas leituras é uma forma poderosa de obter genomas microbianos com a mais alta precisão e fiabilidade.

Principais Características e Vantagens do Sequenciamento Metagenómico de Longa Leitura

• Os maiores comprimentos médios de leitura, com cerca de 50% das leituras a ultrapassarem os 50kb, o que excede o tamanho dos elementos repetitivos no genoma bacteriano médio.
• Sem amplificação de DNA.
• Maior precisão de consenso, baixo viés de contexto de sequenciação.
• Novos programas e pipelines de análise bioinformática
• Pessoal bem experiente

Aplicações da Sequenciação Metagenómica de Longas Leituras

Microbiologia Ambiental:

• Estudar a diversidade microbiana e as funções ecológicas no solo, água e outras amostras ambientais.
• Explore os papéis e interações das comunidades microbianas dentro dos ecossistemas.

Investigação do Microbioma Humano:

• Investigar a composição microbiana e as funções em diferentes locais do corpo humano (por exemplo, intestino, cavidade oral, pele).
• Examine as relações entre a microbiota e a saúde ou estados de doença, como a síndrome metabólica ou doenças inflamatórias do intestino.

Microbiologia Industrial:

• Otimizar estruturas e funções de comunidades microbianas na fermentação e bioprocessamento.
• Desenvolver e selecionar microrganismos e enzimas novas para aplicações industriais.

Ciências Agrícolas:

• Estudar o impacto das comunidades microbianas do solo no crescimento e saúde das culturas.
• Desenvolver fertilizantes microbianos e agentes de biocontrolo para aumentar a produtividade agrícola e a sustentabilidade.

Fluxo de Trabalho de Sequenciação Metagenómica de Longa Leitura

A nossa equipa de especialistas competente implementa uma gestão de qualidade rigorosa em cada etapa para garantir resultados abrangentes e precisos. Aqui está uma visão geral do fluxo de trabalho típico para Sequenciação Metagenómica de Longas Leituras:

Especificações de Serviço

	Requisitos de Amostra DNA genómico ≥ 2 µg, Concentração ≥ 30 ng/µL Tecido ≥ 2 µg, Quantidade Mínima: 1 g Fluido Intersticial ≥6-10 mL, sedimento 2g, Quantidade Mínima: 2 mL, sedimento Amostras Ambientais ≥6g, Quantidade Mínima: 2 g Membrana de filtro de água ≥6, Quantidade mínima: 2 As amostras de DNA requerem um OD260/280 o mais próximo possível de 1,8~2,0. Todo o DNA deve ser tratado com RNase e não deve apresentar degradação ou contaminação. Nota: As quantidades de amostra são listadas apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.
Clique	Estratégia de Sequenciamento Plataformas PacBio biblioteca de 20 K
	Análise Bioinformática Fornecemos várias análises de bioinformática personalizadas: Predição de genes Catálogo de Genes Não Redundantes Anotação funcional: KEGG, eggNOG, CAZy. Anotação taxonómica Caminho, Mapa de Calor, PCA, Agrupamento. … (mais informações disponíveis mediante solicitação) Nota: Os dados recomendados e os conteúdos da análise apresentados são apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes na Sequenciação Metagenómica de Longa Leitura para a sua escrita (personalização)

O sistema PacBio é altamente robusto e rentável, devendo ser a plataforma de escolha em sequenciação metagenómica, particularmente para amostras complexas e comunidades microbianas de baixa diversidade. A CD Genomics será o seu melhor parceiro em sequenciação metagenómica de long-read. Por favor, entre em contacto connosco para mais informações e um orçamento detalhado.

Resultados da Demonstração

Os resultados parciais estão mostrados abaixo:

Perguntas Frequentes sobre Sequenciação Metagenómica de Longa Leitura

1. Por que é que leituras de sequenciamento mais longas são preferíveis para estudos de metagenómica?

Leituras de sequenciamento mais longas oferecem várias vantagens para metagenómica estudos, reforçando tanto a precisão como a abrangência das análises genómicas:

• Montagem Genómica Aprimorada: O comprimento alargado das leituras de sequenciação melhora significativamente a resolução de regiões genómicas complexas, como sequências repetitivas e variações estruturais dentro de genomas microbianos. Isso resulta em montagens genómicas mais contíguas e precisas quando comparadas às montagens derivadas de leituras mais curtas.
• Captura de Genes e Operões de Comprimento Total: O aumento do comprimento das leituras aumenta a probabilidade de capturar genes e operões de comprimento total numa única leitura. Isso facilita anotações funcionais mais precisas e análises de vias, permitindo uma melhor compreensão das funções e interações microbianas.
• Resolução Melhorada da Diversidade Microbiana: Ao abranger múltiplas regiões variáveis dentro dos genomas microbianos, leituras mais longas permitem uma identificação e classificação mais precisas de espécies e estirpes microbianas dentro de comunidades complexas. Esta resolução melhorada é crucial para o estudo da diversidade microbiana e das dinâmicas dos ecossistemas.
• Redução de Montagens Quiméricas: Leituras curtas podem frequentemente resultar em montagens quiméricas, onde sequências de diferentes genomas são combinadas de forma incorreta. O maior contexto de sequência fornecido por leituras mais longas atenua este problema, reduzindo erros de montagem e melhorando a precisão geral dos dados genómicos.
• Perspectivas sobre a Estrutura Genómica Microbiana: Leituras mais longas fornecem informações valiosas sobre as estruturas genómicas dos micróbios, incluindo grupos de genes, elementos genéticos móveis e rearranjos genómicos. Estas informações são essenciais para compreender a evolução microbiana, a adaptação e os mecanismos que sustentam as funções microbianas em diversos ambientes.

2. Como é que o Sequenciamento Metagenómico de Longas Leituras lida com comunidades microbianas complexas?

Sequenciação de leitura longa A tecnologia pode abranger regiões repetitivas e estruturas genómicas complexas de forma mais eficaz do que as tecnologias de leitura curta. Esta capacidade reduz erros de montagem e melhora a precisão das reconstruções do genoma microbiano dentro de comunidades microbianas diversas.

3. Como é que a sequenciação de long-read difere da sequenciação de short-read?

A sequenciação de leitura longa gera leituras que abrangem milhares a dezenas de milhares de pares de bases, em contraste com a sequenciação de leitura curta, que produz leituras tipicamente entre 50 e 300 pares de bases de comprimento. Os comprimentos de leitura alargados inerentes à sequenciação de leitura longa conferem uma vantagem distinta na elucidação de arquiteturas genómicas complexas, sequências repetitivas e estruturas de transcritos completas.

4. Como é que o sequenciamento de leituras longas melhora a qualidade dos dados?

Sequenciação de leitura longa utiliza moléculas nativas de DNA ou RNA, evitando preconceitos ou erros introduzidos durante a amplificação sintética. Também pode superar erros de montagem comuns na sequenciação de leituras curtas, particularmente em regiões com sequências repetitivas, melhorando assim a precisão e a completude dos dados.

5. Quais são os desafios da sequenciação de long-read?

Apesar das suas vantagens, a sequenciação de long-read enfrenta desafios como altos custos, requisitos complexos de análise de dados e exigências técnicas para a preparação de amostras. Alguns estudos podem necessitar de tecnologias complementares para obter um genoma abrangente ou transcriptómico informação.

Estudos de Caso de Sequenciação Metagenómica de Longa Leitura

Descobrir microbiomas da filossfera do arroz utilizando sequenciação metagenómica de leitura longa

Revista: Comunicações Biológicas

Fator de impacto: 6,548

Publicado: 27 de março de 2024

Fundo

A filosfera abriga diversas comunidades microbianas conhecidas como o microbioma das plantas, crucial para o crescimento e saúde das plantas através da absorção de nutrientes e resistência a doenças. Influenciado pela genética do hospedeiro, mecanismos de defesa, fatores ambientais e atividades humanas, a complexidade do microbioma impacta a saúde das plantas de forma imprevisível. Sequenciação de próxima geração revela a diversidade microbiana e o potencial funcional, mas enfrenta preconceitos. A metagenómica de leitura longa supera limitações, permitindo a reconstrução abrangente de genomas e a identificação de novos elementos genéticos, como plasmídeos e bacteriófagos. Aplicada a microbiomas de arroz, revelou novas perspetivas, destacando o seu potencial para a investigação do microbioma das plantas.

Materiais e Métodos

Resultados

Os autores utilizaram o PacBio Sequel II para sequenciar o DNA microbiano associado a folhas, gerando 140 Gbp de dados com um comprimento médio de leitura de 17 kbp e um tamanho médio da biblioteca de 15 kbp. Eles montaram 26.067 contigs (N50 = 128 kbp), incluindo 142 contigs circulares. Mais da metade eram de alta qualidade (>5 profundidades de leitura), representando 80% das leituras e >90% dos nucleotídeos em contigs ≥50 kbp. Todos os contigs ≥1 Mbp eram de alta qualidade, confirmando a fiabilidade para estudar a composição e funções da comunidade bacteriana no microbioma da filossfera do arroz.

Tabela 1. Resumo dos resultados da montagem

O estudo utilizou metagenómica de leitura longa para analisar a composição microbiana utilizando genes 16S rRNA. Identificaram 669 genes 16S rRNA em 561 contigs, com muitos representando espécies bacterianas potencialmente novas. A análise taxonómica revelou 463 sequências com ≥97% de identidade a táxons conhecidos, identificando 59 espécies bacterianas. A comparação com dados de amplicão 16S rRNA de comprimento completo e sequenciação de leitura curta destacou uma maior abundância de Actinobacteria na metagenómica de leitura longa, enfatizando a sua precisão na identificação de comunidades microbianas na filossfera do arroz.

Fig. 1: Visão geral da filogenia dos genes 16S rRNA detectados no metagenoma.

Fig. 2: Abundância relativa de genes 16S rRNA detectados no metagenoma, comparados a sequências de amplicões de comprimento total de genes 16S rRNA e leituras curtas.

O estudo identificou 2.046.382 genes preditos, dos quais 364.262 foram anotados utilizando a base de dados COG. O Methylobacterium dominou categorias funcionais como o metabolismo de aminoácidos e o transporte de carboidratos. Foram reconstruídos 142 contigs circulares, incluindo cromossomos bacterianos e um megaplasmídeo. Novas espécies foram encontradas, e diversos plasmídeos, bacteriófagos e elementos relacionados ao T4SS VirB/VirD4 foram caracterizados, revelando uma vasta diversidade microbiana e potencial genético na filossfera do arroz utilizando metagenómica de leituras longas.

Fig. 3: Características dos contigs circulares (n = 142).

A metagenómica de leitura longa revelou o genoma completo de Candidatus Saccharibacteria bactéria RRA8490, filogeneticamente relacionada à microflora oral humana. A RRA8490 diferiu significativamente de estirpes conhecidas (52,2–54,2% de identidade de aminoácidos), apresentando ausência de genes de síntese de aminoácidos e ácidos gordos, mas codificando vias de metabolismo da glicose, mecanismos de produção de ATP, pili do tipo IV e o complexo de citocromo oxidase (CyoABCDE) para adaptação.

Fig. 4: Metabolismo previsto do RRA8490, uma potencial nova estirpe em o Candidatus Saccharibacteria filo.

Conclusão

Este estudo utilizou extração enzimática de DNA e sequenciação metagenómica de leitura longa para perfilar de forma abrangente a microbiota das plantas. O método revelou plasmídeos e bacteriófagos diversos, e caracterizou um genoma de Candidatus Saccharibacteria adaptado à filossfera do arroz. Estas descobertas sublinham a utilidade da sequenciação de leitura longa para compreender a ecologia microbiana associada às plantas.

Referência

1. Masuda S, Gan P, Kiguchi Y, et al. Descobrindo os microbiomas da filossfera do arroz através de sequenciação metagenómica de longas leituras. Biologia das Comunicações, 2024, 7(1): 357.