Sequenciação do Transcriptoma

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Mutação Genética e Perfil de Expressão com Sequenciação do Transcriptoma

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A CD Genomics tem orgulho em oferecer e personalizar a maioria dos tipos de serviços de transcriptómica para atender aos objetivos de pesquisa e orçamento dos nossos clientes. Estamos aptos a orientá-lo desde o design do projeto, a iniciação do projeto, até resultados de alta qualidade.

O que é o transcriptoma

O transcriptoma é o conjunto de todas as moléculas de RNA, incluindo mRNA, rRNA, tRNA e outros RNA não codificantes, isolados de uma célula ou de uma população de células. A transcriptómica é o estudo de alto rendimento da expressão gênica celular sob condições específicas, catalogando o conjunto completo de transcritos de RNA, incluindo mRNA e RNAs não codificantes. A transcriptómica permite uma análise em todo o genoma da transcrição com resolução de nucleotídeos únicos, incluindo a determinação da abundância relativa de transcritos, identificação imparcial de eventos de splicing alternativo e eventos de edição de RNA pós-transcricional, e detecção de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs). Este método é vantajoso em relação aos métodos existentes, como microarrays e etiquetas de sequência de expressão. É uma ferramenta poderosa para estudos no desenvolvimento de embriões precoces, diferenciação celular, inferência filogenética e descoberta de biomarcadores.

Procedimentos de Estudo de Transcriptómica

O RNA total é primeiramente isolado de uma amostra, depois a preparação da biblioteca pode envolver etapas como enriquecimento de mRNAs baseado em poli-A ou enriquecimento de RNAs baseado em depleção ribossomal, fragmentação de RNA, transcrição reversa para cDNA, ligação de adaptadores e amplificação por PCR. A depleção ribossomal é superior à seleção por poli-A devido ao seu enriquecimento de RNA com ou sem caudas de poli-A. Portanto, o transcriptoma que foi depletado de rRNA é frequentemente considerado como RNA total, incluindo tanto mRNA quanto RNA não codificante. O sequenciamento profundo seguinte é realizado com configuração de Illumina HiSeq (single-end, short-read, ou paired-end, long-read) ou PacBio SMRT (a reação a leituras muito longas). A estratégia de sequenciação de leituras muito longas é capaz de sequenciar os isoformas de comprimento completo sem a necessidade de montagem. O passo final para o estudo de transcriptómica é a análise bioinformática, que geralmente envolve o corte de qualidade dos dados brutos, alinhamento/mapeamento a um genoma de referência ou de novo montagem, manipulação pós-mapeamento e controlo de qualidade, bem como mineração de dados avançada, como a quantificação da expressão génica.

Os nossos Serviços de Transcriptómica Incluem:

• RNA-SeqRevelar a presença de RNAs e os níveis de expressão de RNAs numa determinada condição e tempo, permite a descoberta de novas estruturas genéticas, isoformas alternativamente splicadas, fusões de genes e SNPs/InDels.
• Sequenciação de RNA pequenoPerfis uma variedade de pequenos RNAs não codificantes—miARNs, siARNs, piARNs, snoARNs, snARNs, fragmentos de tRNA (tRFs) e mais. Detecta isoformas, prevê novos sncARNs e infere potenciais alvos e funções.
• Sequenciação de LncRNAFornecer a análise abrangente tanto para lncRNAs (as RNAs não codificantes com mais de 200 nt) como para mRNAs numa única corrida de sequenciação, permitindo a comparação das expressões de lncRNAs e mRNAs e a inferência de funções de lncRNAs e mRNAs.
• Sequenciação de CircRNAFornecer informações sobre a sequência de RNA circular (circRNA) com resolução de uma única base de uma só vez para potenciais aplicações terapêuticas e de investigação.
• Sequenciação DegradómicaAnalise os padrões de degradação do RNA. Identifique os locais de clivagem de miRNA a partir do degradoma de forma eficaz e infira os genes-alvo com precisão.
• Sequenciação de RNA BacterianoFornecer serviço de sequenciação de RNA procariótico para avançar as suas necessidades de perfilagem da expressão génica bacteriana, utilizando as técnicas mais recentes.
• Perfilagem de RibossomasForneça uma estratégia de perfilagem de ribossomas que se baseie no sequenciamento profundo de fragmentos de mRNA protegidos por ribossomas e que permita a investigação em todo o genoma da tradução com resolução subcódigo.
• RNA-Seq totalAnalise tanto o RNA codificante como várias formas de RNA não codificante para uma visão abrangente do transcriptoma.
• Sequenciação de RNA direcionadaFornecimento de informações qualitativas e quantitativas para análise de expressão diferencial, medição de expressão específica de alelos e verificação de fusões genéticas.
• Sequenciação de RNA ExossomalFornecer aos investigadores de exossomas um serviço abrangente para investigar informações de RNA associadas a exossomas.
• sequenciação de RNA com entrada ultra-baixaPermitir o estudo de amostras com um número limitado de células ou com uma quantidade ultra baixa de RNA de entrada.
• RNA-seq dualFornecer uma visão direta sobre a interação entre hospedeiro e patógeno.
• Sequenciação de microRNA: Especificamente, perfila miARNs—pequenas (~21–23 nt) RNAs não codificantes que regulam a expressão génica pós-transcricionalmente. O nosso serviço completo abrange controlo de qualidade de amostras, preparação de bibliotecas, sequenciação de alto rendimento e análise de dados. Receberá quantificação com resolução de base única de miARNs conhecidos, deteção de miARNs novos e insights sobre redes regulatórias miARN–mARN. Perfeito para a descoberta de biomarcadores e estudos de regulação génica.
• Serviço de Sequenciação de mRNAQuantifica transcriptomas codificantes utilizando Illumina NovaSeq. Oferecemos perfis de expressão, deteção de variantes de splicing, identificação de fusões de genes e análise de edição de RNA. Os serviços incluem controlo de qualidade, construção de bibliotecas, sequenciação de alto rendimento e bioinformática avançada adaptada aos objetivos do seu projeto. Ideal para investigação da expressão génica em modelos de doenças e farmacogenómica.

Vantagens do Serviço

Deteção de Todos os Tipos de RNAA sequenciação tradicional do transcriptoma utiliza o método Oligo d(T) para purificar moléculas de RNA com caudas de Poly(A). No entanto, muitas moléculas de RNA populares, como o RNA circular e certos RNAs longos não codificantes (LncRNAs), não possuem caudas de Poly(A), levando à sua perda durante o processamento. A CD Genomics oferece kits de depleção de rRNA projetados para várias espécies, permitindo a retenção de todos os tipos de RNA.

Adequado para Amostras DegradadasA CD Genomics utiliza kits proprietários que são compatíveis com amostras degradadas, permitindo a preservação da informação de RNA em amostras altamente degradadas. Esta abordagem é particularmente adequada para a análise do transcriptoma de amostras clínicas.

Deteção Específica de Cadeias: Muitos loci genéticos produzem RNAs antissenso com funções regulatórias cruciais, transcritos na direção oposta. Os métodos convencionais de preparação de bibliotecas não conseguem distinguir estes RNAs antissenso, mas a CD Genomics utiliza preparação de bibliotecas específica para fitas, permitindo a deteção precisa de RNAs antissenso, proporcionando assim informações mais abrangentes sobre o transcriptoma.

Análise Bioinformática Especializada: Temos uma equipa de bioinformática robusta capaz de satisfazer várias exigências de análise de dados aprofundada para os clientes.

Alta ResoluçãoPode discernir genes semelhantes dentro de famílias de genes e diferenças de nucleotídeos únicos causadas por splicing variável.

Amplitude de Detecção AmplaPode contar com precisão cópias que vão de algumas a dezenas de milhares, identificando e quantificando simultaneamente tanto transcritos comuns como raros.

Análise de Dados

Análise da Expressão de mRNA Diferencial, RNA Circular e RNA Longo Não Codificante (LncRNA)

Após a aquisição de dados de sequenciação de alto rendimento, aplicamos critérios rigorosos, exigindo uma mudança de dobra mínima de ≥ 2 e um nível de significância com um valor de P de ≤ 0,05, para identificar mRNA, RNA circular e LncRNA diferencialmente expressos.

Agrupamento de mRNA Diferencialmente Expresso, RNA Circular e LncRNA

Ontologia Genética (GO) e Análise de Vias de Sinalização de mRNA, RNA Circular e LncRNA Diferencialmente Expressos

A realização de análises de enriquecimento funcional e de vias de sinalização nos genes fonte de mRNA, RNA circular e LncRNA expressos diferencialmente facilita a inferência das funções destas moléculas de RNA.

Construção da Rede de Co-expressão de Longas RNAs Não Codificantes e mRNAs

Aproveitando a associação de co-expressão entre RNA Longo Não Codificante (LncRNA) e RNA mensageiro (mRNA), formulamos um diagrama de rede de co-expressão. Esta abordagem ajuda na identificação de genes-alvo de LncRNA e na dedução das funções de LncRNA.

Análise de RNA endógeno competitivo (ceRNA)

Através da análise da rede de interação entre RNA circular e microRNA, podemos ajudar a desvendar a função e os mecanismos dos RNAs circulares que atuam como esponjas de miRNA.

Construção da Rede circRNA/LncRNA-miRNA-mRNA

Certas moléculas de circRNA/LncRNA podem regular a expressão de genes-alvo de miRNA ao se ligarem a miRNAs. Através da análise de associações circRNA/LncRNA-miRNA-mRNA, podemos ajudar a deduzir as moléculas de circRNA/LncRNA que atuam como esponjas de miRNA e os seus mecanismos de ação.

A nossa combinação única de leituras longas e curtas, sequenciação de extremidade única e pareada, especificidade de fita e capacidade para dezenas de milhões a biliões de leituras por corrida permite-nos sequenciar as suas amostras de diversas maneiras. O nosso pessoal experiente pode ajudá-lo a definir como os nossos serviços podem ser melhor aproveitados para o seu projeto, e o nosso rigoroso controlo de qualidade pode garantir a integridade dos resultados entregues. Sinta-se à vontade para contactar os nossos especialistas e discutir estratégias adequadas para a preparação de bibliotecas e sequenciação.