Serviço de Sequenciação de mRNA

O que é Sequenciação de mRNA

O mRNA é transcrito a partir de genes codificadores de proteínas e serve como a molécula de RNA intermediária que transfere informação genética do DNA para as proteínas. Em eucariotos, o DNA é inicialmente transcrito em pré-mRNA, que passa por uma série de etapas de processamento para formar mRNA maduro. O mRNA maduro é então transportado para o citoplasma e traduzido por ribossomas em proteínas. A maturação do mRNA envolve três eventos principais de processamento: splicing, captação 5' e poliadenilação 3'. Como resultado, as moléculas de mRNA maduro possuem uma cauda poli(A) na sua extremidade 3'.

Fig 1. O que é mRNA.

mRNA-seq é uma sequenciação de alto rendimento tecnologia desenvolvida para detectar a expressão e processamento de mRNA. O estudo do sequenciamento de mRNA em eucariotos foca na coleta de mRNAs transcritos de células ou tecidos específicos sob certos estados funcionais. Pode ser utilizado para investigar a expressão diferencial de mRNA, detectar variações estruturais e rastrear marcadores moleculares associados a doenças ou características. Também pode revelar a complexidade do transcriptoma, determinar estruturas de genes e transcritos, splicing variável, edição de RNA, RNAs não codificantes poliadenilados e transcritos novos. Atualmente, o mRNA-seq tem sido amplamente aplicado em áreas como pesquisa básica, melhoramento molecular, diagnóstico clínico e desenvolvimento de medicamentos.

Princípio Técnico do mRNA-seq

Para RNA contendo caudas de poli(A), como mRNA e alguns lncRNAs, a enriquecimento é realizado utilizando oligo dT, que captura o RNA poliadenilado, também conhecido como PolyA-Seq. O mRNA/lncRNA enriquecido é então fragmentado, transcrito reversamente, ligado a adaptadores de sequenciamento comuns e amplificado por PCR para gerar bibliotecas de sequenciamento. Os dados de sequenciamento resultantes são submetidos a uma análise bioinformática para obter informações sobre a expressão gênica, splicing alternativo, edição de RNA e outras características presentes no RNA.

Fig. 2. Fluxo de trabalho geral do mRNA-seq.

Vantagens do nosso Serviço de Sequenciação de mRNA

• Comparado com microarrays de expressão génica, o mRNA-Seq tem várias vantagens em análise do transcriptoma:
• Tem uma gama dinâmica mais ampla, aumentando tanto a sensibilidade como a precisão na medição das alterações de dobra na expressão génica.
• Pode capturar características conhecidas, bem como características novas.
• Pode ser amplamente aplicado a várias espécies.
• Além de calcular os níveis de expressão génica, pode detetar variações de sequência e estruturais nos transcritos.
• O aumento da profundidade de sequenciação permite uma gama dinâmica mais ampla de deteção, possibilitando a identificação e quantificação de transcritos tanto altamente abundantes como de baixa abundância, num intervalo de seis ordens de magnitude.
• Além de detetar os níveis de expressão de transcritos conhecidos, também pode descobrir transcritos novos.
• Quando aplicado a espécies sem um genoma de referência, pode descobrir novos genes através da montagem de novo.

Fluxo de Trabalho do Serviço de Sequenciação de mRNA

Para mRNA-Seq, a nossa empresa oferece serviços experimentais que incluem, mas não se limitam a, construção de bibliotecas e sequenciação com base em tecidos e linhas celulares, bem como serviços de análise e interpretação bioinformática personalizados e otimizados.

Especificação do Serviço

	Requisitos de Amostra RNA total ≥ 500 ng, Quantidade Mínima: 200 ng, Concentração ≥ 20 ng/µl Células ≥ 1×106 Tecido ≥ 50 mg, Quantidade Mínima: 10 mg Relação OD A260/A280 ≥ 1,8, relação A260/230 ≥ 1,8, RIN ≥ 6 Todas as amostras de RNA total devem estar isentas de DNA. O RNA deve ser armazenado em água livre de nucleases ou RNA Stable. Nota: Os montantes de amostra são listados apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.
Clique	Estratégias de Sequenciamento Illumina NovaSeq, PE 150 Quantidade de dados de sequenciação: 5 Gb de dados brutos
	Análise de Dados Fornecemos múltiplas análises de bioinformática personalizadas: Controlo de qualidade Filtragem Alinhamento ao genoma de referência quantificação de mRNA Análise diferencial de genes Análise de agrupamento de amostras Análise de enriquecimento funcional de genes diferencialmente expressos Análise de interação proteica de genes diferencialmente expressos Análise estrutural de redes de interação Nota: Os dados de saída e os conteúdos de análise recomendados exibidos são apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes na Sequenciação de mRNA para a sua escrita (personalização)

Na CD Genomics, oferecemos serviços de sequenciação de mRNA de ponta, projetados para atender a diversas necessidades de pesquisa. O nosso serviço inclui um rigoroso controlo de qualidade das amostras, preparação especializada de bibliotecas, sequenciação de alto rendimentoe análise de dados detalhada. Priorizamos a entrega de resultados precisos e abrangentes que se alinhem com os objetivos específicos da sua pesquisa. Entre em contacto connosco para explorar como as nossas soluções de sequenciação de mRNA podem apoiar e melhorar os seus esforços científicos.

Os resultados parciais estão apresentados abaixo:

Distribuição da qualidade de sequenciação

Distribuição A/T/G/C

Interface do Navegador IGV

Análise de Correlação Entre Amostras

Gráfico de Pontuação PCA

Diagrama de Venn

Gráfico de Volcano

Resultados Estatísticos da Anotação GO

Classificação KEGG

1. Todos os eucariotos podem realizar sequenciação de mRNA?

O mRNA eucariótico contém uma cauda poli-A, e o método comum para enriquecer o mRNA eucariótico envolve a captura do mRNA a partir do RNA total utilizando esferas magnéticas ligadas a oligonucleotídeos poli-T, seguido pela construção de bibliotecas para sequenciação. Portanto, teoricamente, todos os eucariotos podem passar por sequenciação de mRNA.

2. Por que é que a sequenciação de mRNA requer uma integridade de RNA mais elevada do que a sequenciação do transcriptoma completo?

Na construção de bibliotecas de sequenciação de mRNA, as moléculas de RNA com uma cauda poli-A são capturadas utilizando esferas magnéticas. Se a integridade do RNA for baixa e o mRNA estiver parcialmente degradado, levando à perda da cauda poli-A, o mRNA capturado de amostras com menor integridade é reduzido, resultando em uma cobertura gênica inferior. Assim, é necessário um nível mais elevado de integridade do RNA.

3. O mRNA-seq pode detectar RNA não codificante?

A mRNA-seq captura principalmente moléculas de RNA com uma cauda poli(A); assim, teoricamente, qualquer molécula com cauda poli(A) expressa na célula pode ser detectada. Isso inclui mRNA e longos RNAs não codificantes com caudas poli(A).

4. Qual é a diferença entre RNA-seq total e mRNA-Seq?

RNA-Seq TotalA sequenciação do transcriptoma completo é um método exaustivo que abrange a sequenciação de todas as espécies de RNA após a remoção do RNA ribossómico (rRNA), incluindo RNAs codificantes e não codificantes. Isso inclui RNA como rRNA, RNA mensageiro precursor (pre-mRNA), RNA mensageiro (mRNA) e uma variedade de RNAs não codificantes (ncRNA), como RNA transportador (tRNA), microRNA (miRNA) e RNA longo não codificante (lncRNA). Por outro lado, a mRNA-Seq visa especificamente regiões codificantes ao enriquecer RNA poliadenilado (poly(A)), tornando-a uma abordagem mais económica e simplificada para estudos focados principalmente na análise de mRNA.

5. Deve escolher sequenciação de mRNA ou sequenciação de RNA total?

para pesquisas envolvendo organismos eucariotos e com um interesse primário nas regiões codificantes, o mRNA-Seq é a escolha ideal. A abordagem mRNA-Seq enriquece o mRNA através da seleção de Poly(A), reduzindo os custos e a complexidade do sequenciamento, sendo particularmente adequada para amostras com material inicial limitado. Por outro lado, se for necessária uma análise abrangente que inclua todo o RNA, incluindo moléculas de RNA codificantes e não codificantes, é necessário, RNA-Seq total é a opção preferida, apesar do seu custo mais elevado e da maior demanda por dados de sequenciação. A seleção entre métodos deve ser baseada em objetivos experimentais específicos, questões biológicas, tipos de amostras e restrições orçamentais.

Mecanismo molecular subjacente à diferenciação da tolerância ao cádmio em Lentinula edodes como revelado por análises de mRNA e milRNA

Revista: Revista de Materiais Perigosos
Fator de impacto: 14,224
Publicado: 15 de Outubro de 2022

Fundo

O cádmio (Cd) é um metal pesado tóxico amplamente distribuído, capaz de induzir várias doenças no corpo humano, como cancro da mama e cancro renal. Com o rápido desenvolvimento das atividades industriais e agrícolas, a contaminação por cádmio tornou-se um problema global sério. Portanto, é essencial remediar áreas contaminadas por Cd. A remediação fúngica é uma técnica de restauração nova e importante, no entanto, os mecanismos moleculares subjacentes às respostas fúngicas ao stress por metais pesados continuam pouco claros. Este estudo realizou sequenciação do transcriptoma analisar a expressão diferencial de mRNA e miRNA entre cogumelos tolerantes ao Cd (YS119) e sensíveis ao Cd (YS45). Os resultados fornecem uma base teórica para a exploração adicional dos mecanismos moleculares da tolerância ao cádmio em fungos e ajudam a elucidar os papéis potenciais dos miRNAs nas respostas fúngicas ao stress por metais pesados.

Materiais e Métodos

Resultados

Análise de Sequenciação de mRNA

Um total de 577.586.098 leituras brutas foram obtidas de todas as amostras, resultando em 577.165.672 leituras limpas após a filtragem. Os coeficientes de correlação de Pearson e a Análise de Componentes Principais (PCA) indicaram uma alta reprodutibilidade entre os replicados biológicos das amostras, permitindo uma análise mais aprofundada (Figura 1A, B).

Figura 1 Coeficiente de correlação de Pearson e análise PCA.

Sob estresse de Cd, YS45 exibiu uma resposta mais forte em comparação com YS119, com 2036 genes diferencialmente expressos (DEGs) em YS45 (1034 regulados para cima, 1002 regulados para baixo) em comparação com 370 DEGs em YS119 (239 regulados para cima, 131 regulados para baixo). As análises de GO e KEGG revelaram que ambas as variedades de cogumelos tinham 170 DEGs regulados para cima em comum, enriquecidos em 14 categorias de GO e um caminho KEGG, e 107 DEGs regulados para baixo em comum, enriquecidos em 12 categorias de GO e um caminho KEGG, indicando que genes envolvidos na estabilidade proteica, ligação iónica e atividade redox desempenham papéis na resposta ao estresse de Cd. Especificamente, YS45 tinha 863 genes regulados para cima de forma única, enriquecidos em 20 categorias de GO e 12 caminhos KEGG, enquanto YS119 tinha 64 genes regulados para cima de forma única, enriquecidos em 11 categorias de GO e um caminho KEGG.

Além disso, o YS45 apresentou 890 genes unicamente regulados para baixo, enriquecidos em 22 categorias GO e 8 vias KEGG, enquanto o YS119 teve 23 genes unicamente regulados para baixo, enriquecidos em 7 categorias GO, sem enriquecimento em vias KEGG. Isto sugere que a severa supressão de genes relacionados com a remodelação da parede celular, reparo do DNA, metabolismo de açúcares e proteólise sob estresse por Cd pode reduzir a tolerância ao Cd do YS45, com a expressão diferencial de genes envolvidos na regulação da transcrição, transporte, metabolismo de lípidos, ligação a metais, metabolismo de glutationa e homeostase redox a contribuir para as diferenças de tolerância entre as duas variedades.

Figura 2 Análise de DEGs.

2. Análise integrada de mRNA e miRNA

Os miARNs regulam a expressão génica degradando ou inibindo os seus mARNs alvo. No YS45, entre 1620 alvos de miARNs diferencialmente expressos (DE), 216 são genes diferencialmente expressos (DEGs), dos quais 111 mostram tendências de expressão opostas aos miARNs (Figura 3A, B). Os genes potencialmente regulados negativamente por estes miARNs incluem aqueles que codificam fatores de transcrição (TFs), proteínas de transporte, citocromo P450s, proteínas de reparação de DNA como MutL, proteases, transferases de glutationa e enzimas ativas em carboidratos (CAZymes). No YS119, de 525 alvos de miARNs diferencialmente expressos, apenas 14 são DEGs, com 3 mostrando tendências de expressão opostas (Figura 3C, D), codificando hidrolase de glicosídeos, proteína de crescimento de celulose e desidrogenase de retinol.

Estes resultados sugerem que os miARNs podem não afetar significativamente a expressão da maioria dos genes-alvo nos cogumelos. A degradação do mARN pode não ser o principal mecanismo regulador; em vez disso, a inibição da tradução e a competição com RNAs endógenos pela ligação aos miARNs podem desempenhar papéis chave.

Figura 3 Análise integrada de mRNA e miRNA.

Conclusão

Este estudo investiga os notáveis mecanismos moleculares subjacentes às diferenças na tolerância ao cádmio (Cd) entre duas variedades de cogumelos, YS45 e YS119. Sob estresse de Cd, YS45 apresentou uma maior agregação de proteínas em comparação com YS119, afetando as atividades celulares normais e diminuindo a tolerância ao Cd do cogumelo. Análises comparativas de mRNA e miRNA revelaram a envolvência de genes ou miRNAs associados à remodelação da parede celular, transporte, quelatação de metais, homeostase redox, transdução de sinais, regulação transcricional, metabolismo de lipídios e carboidratos, hidrólise de proteínas, reparo de DNA e regulação do ciclo celular na modulação da tolerância ao Cd. Além disso, a superexpressão do gene LeAmy confirmou o seu papel no aumento da tolerância ao Cd em cogumelos. Os achados estabelecem uma base teórica para uma compreensão mais profunda dos mecanismos moleculares por trás das diferenças na tolerância ao Cd em cogumelos, ajudando no desenvolvimento de cultivares fúngicos tolerantes a metais pesados.

Referência:

1. Shen N, Xu C, Zhang J, et al. Mecanismo molecular subjacente à diferenciação da tolerância ao cádmio em Lentinula edodes como revelado por análises de mRNA e milRNA. Revista de Materiais Perigosos, 2022, 440: 129841.