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Perguntas e Respostas sobre Sequenciação de RNA Total

  • Perguntas Gerais
  • Que tipos de serviços de sequenciação de RNA total você oferece?
    • CD Genomics Serviço de Sequenciamento de RNA Total é uma solução poderosa e abrangente para analisar o transcriptoma celular. O RNA-Seq total tem uma ampla gama de aplicações, desde estudos básicos da estrutura e função celular até a deteção e análise de várias doenças. Por exemplo, as alterações na expressão génica antes e depois de uma intervenção terapêutica podem ser comparadas para determinar a presença ou ausência de doença. O RNA-Seq também pode ser utilizado para detectar splicing alternativo, modificações pós-transcricionais e análise de exões e íntrons. Os dados obtidos podem fornecer informações valiosas sobre os mecanismos celulares subjacentes, a estrutura do genoma e os efeitos indutores de doenças.
  • Como funciona o Total RNA-Seq?
    • O processo de RNA-Seq gira em torno da construção de uma biblioteca de DNA complementar (cDNA) para sequenciação. A construção da biblioteca começa com a isolamento do RNA celular, seguido por ensaios de controlo de qualidade para determinar a integridade do RNA. Subsequentemente, o RNA alvo na biblioteca pode ser enriquecido utilizando either remoção ou um ensaio de triagem. O RNA é então transcrito reversamente em cDNA antes da sequenciação.
  • Devo escolher sequenciação de RNA total ou sequenciação de mRNA?
    • A escolha entre usar RNA-Seq total ou mRNA-Seq depende do propósito do experimento. A sequenciação de RNA total fornece a análise mais abrangente de todo o transcriptoma. Se forem estudados eucariotos e apenas as regiões codificantes forem de interesse, e se houver material inicial limitado disponível, a sequenciação de mRNA é a solução ideal.
  • Que tipos de espécies de RNA podem ser obtidas através da sequenciação de RNA total?
    • O RNA-Seq total é o sequenciamento de RNA do qual foi removido o RNA ribossómico (rRNA), que contém uma variedade de moléculas de RNA. Estas incluem RNA mensageiro precursor (pre-mRNA), RNA mensageiro (mRNA) e muitos tipos de RNA não codificantes (ncRNA), como RNA de transferência (tRNA), microRNA (miRNA) e RNA longo não codificante (lncRNA, transcritos com mais de 200 nucleotídeos que não foram traduzidos em proteínas).
  • Quais estratégias utilizar para melhorar a qualidade dos dados de sequenciação de RNA?
    • A remoção de ribossomas ou o enriquecimento de mRNA podem melhorar a qualidade dos dados de sequenciação. Ambas as abordagens permitem a sequenciação apenas da molécula de RNA alvo e minimizam o desperdício de leituras de sequenciação.
      A remoção de transcritos de rRNA permite que mais leituras de sequenciamento se concentrem nos transcritos desejados, melhorando assim a sensibilidade do sequenciamento. A etapa de remoção de rRNA é particularmente importante se o nível de expressão do transcrito desejado for bastante baixo. A seleção de Poly-A é suficiente para estudar mRNA em eucariotos. E a análise de lncRNA ou transcritos bacterianos requer a depleção de rRNA.
  • Quais plataformas de sequenciação são utilizadas para RNA-Seq?
    • O RNA-Seq padrão, específico para filamentos, de célula única, de entrada pequena e ultra-baixa utiliza sequenciação de leituras curtas em plataformas Illumina como NovaSeq e HiSeq.
  • Consegue analisar pequenos RNAs ou miARNs?
    • Sim, o RNA-Seq total fornece informações sobre RNAs codificadores, bem como sobre RNAs não codificadores, como lncRNAs e miRNAs.
  • Quanto de dados de sequenciação preciso em Sequenciação de RNA Total?
    • A RNA-Seq total requer mais dados de sequenciação (tipicamente 100-200 milhões de leituras de sequenciação por amostra). Para espécies maduras como humanos, ratos e camundongos, 6G bases são suficientes para estudar apenas a expressão de mRNA, e 12-15G é recomendado para a expressão de lncRNA. 5-10M leituras são basicamente suficientes para sequenciação de pequenos RNAs. Para outras espécies ou necessidades, pode-se contacte-nos para mais informações.
  • Que análise bioinformática fornece o sequenciamento total de RNA?
    • Temos uma equipa completa de suporte em bioinformática para fornecer análise de dados adicional para pedidos rotineiros e personalizados. Isto inclui, mas não se limita a, análise de splicing alternativo, identificação de novos transcritos, análise de genes de fusão, deteção de SNPs, bem como análise diferencial, análise de tendências e análise de enriquecimento.
      Visite as seguintes páginas para mais informações sobre A Análise Bioinformática de RNA-Seq.
  • Preparação de Amostras
  • Que tipos de amostras suportamos?
    • Apoiamo uma ampla variedade de amostras, como células, tecidos, FFPE, sangue, urina e exossomas. Para mais informações, por favor leia o nosso submissão de amostra específica ou submeter uma consulta aqui.
  • Como extrair RNA total?
    • A extração de RNA começa com a homogeneização da amostra, seguida pela lise das células para libertar o RNA. O RNA é então condicionado para se ligar a uma coluna de captura e lavado para remover sais e outros contaminantes antes de ser eluído. Qualquer DNA genómico contaminante pode ser removido com métodos baseados em coluna ou enzimáticos.
      Confira o nosso Protocolo de Extração/Purificação de RNA Total para mais informações.
  • Como devo recolher amostras?
    • O RNA é muito degradável e dá-se preferência a tecidos frescos e em crescimento vigoroso. As amostras celulares precisam de ter pelo menos 10^7. As amostras de sangue total não devem ser inferiores a 5 ml. As amostras precisam ser congeladas em nitrogénio líquido e armazenadas a -80°C. As amostras devem ser devidamente seladas e enviadas em gelo seco.
  • Como Fazer um Pedido
  • Como devo preparar e enviar amostras?
  • Que tipo de dados vou receber?
    • A nossa entrega de dados e formato varia consoante a plataforma/aplicação e segue os padrões da indústria NGS. Os dados de sequenciação, filtrados e não filtrados, são tipicamente entregues como ficheiros fastq. Os alinhamentos de referência são fornecidos como ficheiros .bam. As chamadas de SNP e/ou variantes são fornecidas como ficheiros VCF. Também oferecemos formatos de dados e relatórios personalizados para atender às suas necessidades específicas.
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