Diretrizes para Submissão de Amostras de Sequenciamento de Alto Rendimento

amostras de ADN

As amostras de DNA devem ser armazenadas a -20℃. Para armazenamento ou transporte a curto prazo, as amostras de DNA podem ser armazenadas a 4℃ ou transportadas utilizando pacotes de gel de gelo ou bolsas de gelo. Para transporte a longo prazo, recomenda-se o uso de gelo seco e bolsas de gelo. Os requisitos das amostras de DNA estão mostrados na Tabela 1.

Tabela 1. Requisitos da amostra de DNA.

Tipo de sequenciamento	Tipo de biblioteca	Requisito de amostra
sequenciação genómica	Biblioteca de fragmentos pequenos	≥ 300ng, OD260/280: 1.8-2.2, concentração > 10ng/μl, volume > 10μl. As bandas de DNA da eletroforese em gel de agarose são claras e sem degradação, sem contaminação de RNA e proteínas, e as amostras são claras, incolores, pegajosas e solúveis.
sequenciação genómica	Biblioteca Pacbio (Biblioteca 10/20K)	≥ 10μg, concentração > 100ng/μl, razão OD260/280: 1.8-2.0, razão OD260/230: 2.0-2.2. A razão da concentração do Nanodrop em relação à concentração do Qubit é ≤ 2, a amostra é clara e incolor, e não há matéria insolúvel; a banda de DNA na eletroforese em gel de agarose é clara e não apresenta degradação do DNA, livre de contaminação por RNA e proteínas.
Sequenciação de metagenomas		≥ 300ng, OD260/280: 1.8-2.2, concentração > 2ng/μl, volume > 10μl. As tiras de gel de agarose estão claras e não estão significativamente degradadas.
Sequenciação de 16S/18S/ITS		≥ 15ul, a concentração do resultado de amplificação ≥ 10nM e a concentração genómica ≥ 0,05ng/ul.
ChIP-Seq		≥ 30ng, concentração ≥1ng/μl, volume ≥10μl, a forma do pico é normalmente distribuída entre 100-500bp, com um pico principal entre 200-400bp. A amostra é clara, incolor, não viscosa, solúvel e livre de contaminação por proteínas.
Sequenciação de metilação do genoma completo		≥ 1,5μg, a razão de 260/280 está entre 1,8-2,2, a concentração ≥ 20ng/μl, e o volume é superior a 10μl. A banda da eletroforese em gel de agarose não apresenta degradação significativa, e a amostra é clara e incolor, não viscosa e livre de matéria insolúvel.
Sequenciação do exoma	Amostra genómica, basicamente sem degradação.	≥ 300ng, razão 260/280 entre 1.8-2.2, concentração ≥ 2ng/μl, volume ≥ 10μl. A banda da eletroforese em gel de agarose não mostra degradação significativa, e a amostra é clara e incolor, não viscosa e livre de matéria insolúvel.
Sequenciação do exoma	Amostras especiais como FFPE permitem uma ligeira degradação.	≥ 400ng, a razão de 260/280 está entre 1,8 e 2,2, a concentração ≥ 4ng/μl, e o volume ≥ 10μl. A banda da eletroforese em gel de agarose está acima de 500bp.
Sequenciação de amplicões	Pequeno fragmento de biblioteca construída diretamente	≥ 150ng, razão 260/280: 1.8-2.2, concentração ≥ 2ng/μl, volume ≥ 10μl. O tamanho do fragmento está entre 100bp e 500bp, e a amostra é clara e incolor, não viscosa e livre de matéria insolúvel.
Sequenciação de amplicões	Necessita de interromper (tamanho do segmento >1000pb)	≥ 500 ng, a razão de 260/280 está entre 1,8 e 2,2, a concentração é ≥ 20 ng/μl e o volume é ≥ 10 μl. A banda da eletroforese em gel de agarose é clara e não está significativamente difusa, e a amostra é clara e incolor, não viscosa e livre de matéria insolúvel.
Amostra de biblioteca		A concentração da biblioteca ≥ 3nM (concentração quantitativa qPCR), a concentração da biblioteca da pista ≥ 5nM (concentração quantitativa qPCR), o volume ≥ 15μl. A amostra não contém esferas magnéticas, e a biblioteca é compatível com a plataforma de sequenciação designada. Outras notas: 1) A biblioteca de DNA está dissolvida em um tampão apropriado de Illumina Resuspension Buffer (RSB) ou outro tampão. 2) Os clientes devem fornecer informações sobre a espécie, tamanho do fragmento, método de construção do banco de dados, gráfico de inspeção de qualidade do Agilent 2100 Bioanalyzer e resultados do Qubit. 3) O tamanho da biblioteca HiSeq está entre 300bp e 500bp, o tamanho da biblioteca MiSeq está entre 300bp e 600bp (sem dímeros de primer e dímeros de ligador).

amostra de RNA

As amostras de RNA devem ser armazenadas a -80°C. Gelo seco ou nitrogénio líquido podem ser utilizados para armazenamento ou transporte a curto prazo. Para transporte a longo prazo, recomenda-se que o RNA seja precipitado em 75% de etanol e transportado com gelo seco ou gelo azul suficiente (2 kg/dia). Os requisitos das amostras de RNA estão apresentados na Tabela 2.

Tabela 2. Requisitos da amostra de RNA.

Tipo de sequenciamento	Tipo de espécie	Requisito de amostra
Biblioteca de triagem PolyA	Mamíferos	≥ 2μg, 260/280 ≥ 2.0, RIN > 7, 28S/18S ≥ 1.0, concentração > 50ng/μl, volume ≥ 10 μl, pico de 5S normal. A forma do pico 2100 é normal, a amostra é clara e incolor, sem viscosidade, sem matéria insolúvel.
	Insetos	≥ 2μg, 260/280 ≥ 2.0, concentração > 50ng/μl, volume ≥ 10μl, sem aumento (deleção) na linha de base, pico 5S normal. A forma do pico 2100 é normal, a amostra é clara e incolor, sem viscosidade, sem matéria insolúvel.
	Plantas, fungos, leveduras, outros animais	≥ 2μg, 260/280 ≥ 2.0, RIN > 6.5, 28S/18S ≥ 1.0, concentração > 50ng/μl, volume ≥ 10μl, pico de 5S é normal. A forma do pico 2100 é normal, a amostra é clara e incolor, sem viscosidade, sem matéria insolúvel.
biblioteca de remoção de rRNA	Organismos eucarióticos (lncRNA)	≥ 2μg, 260/280 ≥ 2.0, RIN > 7, 23S/16S ≥ 1.0, concentração > 100 ng/μl, volume ≥ 10μl, pico de 5S é normal.
biblioteca de remoção de rRNA	Procariontes	≥ 2μg, 260/280 ≥ 2.0, RIN > 7, 23S/16S ≥ 1.0, concentração > 100 ng/μl, volume ≥ 10μl, pico de 5S é normal. A amostra é clara, incolor, não viscosa e livre de insolúveis.
Sequenciação de RNA pequeno	Mamíferos	≥ 2μg, 260/280 ≥ 2.0, RIN > 8, 28S/18S ≥ 1.0, concentração > 170ng/μl, volume ≥ 10μl, pico 5S normal. A amostra é clara, incolor, não viscosa e livre de insolúveis.
	Insetos	≥ 2μg, 260/280 ≥ 2.0, concentração > 170 ng/μl, volume ≥ 10μl, sem elevação na linha de base, pico 5S normal. A amostra é clara, incolor, não viscosa e livre de insolúveis.
	Plantas, fungos, leveduras, outros animais	≥ 2μg, 260/280 ≥ 2.0, RIN > 7.5, 28S/18S ≥ 1.0, concentração > 170 ng/μl, volume ≥ 10μl, pico de 5S normal. A amostra é clara, incolor, não viscosa e livre de insolúveis.
Transcritos de macrotranscriptoma		≥ 3μg, concentração ≥ 100ng/μl, RIN ≥ 6.5, volume ≥ 10μl, a amostra é clara e incolor, sem viscosidade, sem matéria insolúvel.
Sequenciação do transcriptoma de comprimento completo		3-5μg ou mais, concentração ≥ 500ng/μl, 260/280 ≥ 2.0, RIN > 9, 23S/16S ≥ 1.0, o volume ≥ 10μl, e o pico de 5S é normal.

Amostra de tecido

Se o ADN for isolado, as amostras de tecido podem ser armazenadas ou transportadas por um curto período de tempo, e devem ser armazenadas ou transportadas a 4 °C. Para transporte a longo prazo, recomenda-se gelo seco e pacotes de gelo. Se o ARN for extraído, as amostras de tecido devem ser transportadas utilizando gelo seco ou nitrogénio líquido. Por favor, marque claramente o nome da amostra, coloque o tubo da amostra dentro de um tubo de centrífuga de 50 ml ou caixa de amostras, e depois envolva-o adequadamente com espuma ou algodão para garantir que a amostra chegue em boas condições ao nosso laboratório.

Os requisitos para amostras de tecido estão apresentados na Tabela 3 e 4.

DNA Os rendimentos de DNA de diferentes tipos de amostras variam bastante. Por favor, envie as amostras de acordo com as condições reais das amostras e os requisitos para a construção da biblioteca de sequenciação. As amostras de tecido para serviços de sequenciação relacionados com DNA devem ser enviadas com pacotes de gelo.

Tabela 3. Requisitos de amostras de tecido para sequenciação de DNA.

Tipo de amostra	Requisito de amostra
Sangue	≥ 2ml de anticoagulação fresca ou criopreservada (sangue total ou glóbulos brancos extraídos de sangue total), recomenda-se o anticoagulante EDTA, e a anticoagulação com heparina não pode ser utilizada para evitar afetar o experimento.
Tecido isolado	≥ 0,5 g de tecido animal, ≥ 2 g de tecido vegetal.
Célula	≥ 5X10⁶
Amostra bacteriana	≥ 1g do precipitado do corpo bacteriano (cerca de ≥ 10ml na fase de crescimento logarítmico do líquido bacteriano); Biblioteca Pacbio: é necessário ≥ 15g do corpo bacteriano para o precipitado (cerca de ≥ 150ml na fase de crescimento logarítmico).
amostra FFPE	Pelo menos 10 cortes sem coloração HE, com espessura de ≥ 5 micrómetros, a área do tecido no corte deve ser ≥ 25 milímetros quadrados, dos quais o número de células nucleadas representa mais de 80% de todas as células, e o conteúdo de tecido celular tumoral ≥ 70%.
amostra de sequenciação 16S/ITS/18S	Quantidade precipitada > 2g, volume > 10ml, que é especificamente determinada de acordo com a abundância do microrganismo.
Amostra metagenómica	Amostras ambientais: 5-10g de solo; 3-5g de fezes; 5-10g de sedimento; 25ml de solução. Água: volume: 5-10ml, passada por um filtro de tamanho de poro de 0,22μm ou 0,45μm.

RNA Os rendimentos de RNA de diferentes tipos de amostras variam bastante. Por favor, envie amostras de acordo com as condições reais das amostras e os requisitos de construção da biblioteca de sequenciação. As amostras de tecido para serviços de sequenciação relacionados com RNA são transportadas utilizando gelo seco ou nitrogênio líquido, salvo indicação em contrário.

Tabela 4. Requisitos de amostras de tecido para sequenciação de RNA.

Tipo de amostra	Requisito de amostra
Sangue	≥5 ml de linfócitos coletados de sangue total. A quantidade de amostras de aves ou peixes pode ser reduzida adequadamente. Recomenda-se que os linfócitos sejam completamente lisados com 20 volumes de TRIzol LS. Os clientes também podem enviar amostras de sangue total congeladas em nitrogênio líquido. Sugere-se adicionar 3 vezes o volume de líquido lítico TRIzol LS ao sangue fresco e enviá-lo com gelo seco. Os clientes devem assumir o risco da extração da amostra.
Tecido fresco	≥ 500mg. Ou aumente a quantidade da amostra se a amostra contiver fibra muscular ou gordura, pois tem um baixo teor de RNA. ≥ 1g de tecido vegetal. Para tecidos vegetais complexos que contêm polissacarídeos e polifenóis, por favor envie o maior número possível de amostras. Recomenda-se que o tecido fresco seja envolto em papel de alumínio ou embalado em tubos EP após a lavagem e congelado em azoto líquido dentro de 3 minutos.
Célula	≥ 5X10⁶Por favor, lave e precipite o pellet, totalmente lisado com TRIzol, e envie-o.
Amostra bacteriana	≥ 500mg de precipitação de bactérias frescas é rapidamente congelado em azoto líquido dentro de 3 minutos. Amostras fúngicas não são recomendadas para preservação em lise com TRIzol.
Amostra de sequenciação de alto rendimento	Os clientes recolhem células PBMC de sangue; O número total de células é entre 1X10.⁶-5X10⁶, completamente lisado com 1ml de TRIzol; envie-o com gelo seco.

Leituras Adicionais

Os Métodos para Extração e Purificação de DNA

Recuperação de DNA Plasmidial de Culturas Bacterianas sem Utilizar Kits

Apenas para fins de investigação, não se destina a diagnóstico clínico, tratamento ou avaliações de saúde individuais.

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