Os Métodos para Extração e Purificação de DNA

Uma Breve Introdução ao DNA

O ácido desoxirribonucleico é uma das moléculas mais importantes baseadas na vida que transporta instruções genéticas para guiar a herança biológica, o desenvolvimento biológico e o funcionamento vital. A estrutura do DNA em células eucarióticas é chamada de dupla hélice, formada pelo enrolamento antiparalelo de duas cadeias de polinucleotídeos. A extração de DNA é um passo crítico e básico envolvido em experimentos moleculares. Em muitos laboratórios, o método de lise alcalina é utilizado para extrair DNA. Para uma extração de DNA bem-sucedida, existem vários critérios de medição; é necessário garantir a integridade da estrutura primária do ácido nucleico, A260/A280=1.8~2.0, a baixa concentração de íons de sal e a poluição mínima de outras biomacromoléculas, como proteínas, polissacarídeos e moléculas lipídicas. DNA de alta qualidade e purificado é muito importante para a pesquisa subsequente, como pesquisa genômica e pesquisa epigenômica.

Extração de DNA de Células Cultivadas in vitro

1. Coletar células. (As células são diretamente centrifugadas para obter o pellet celular, e as células aderentes precisam ser digeridas com tripsina e coletadas por centrifugação.)

2. Ressuspender as células e enxaguar uma vez com PBS pré-resfriado.

3. Repetir o passo 2.

4. Adicionar 2 mL de tampão de extração de DNA (10 m mol/L Tris-cl, 0.1 mol/L EDTA, 0.5% SDS) e misturar.

5. Adicionar proteinase K a uma concentração final de 100 μL/mL e realizar um banho-maria a 50 °C por 3 horas.

6. Adicionar um volume igual de fenol, centrifugar a 2.500 rpm por 15 minutos e coletar a fase aquosa.

7. Adicionar um volume igual de mistura de fenol, cloroformio e álcool isoamílico, centrifugar a 2.500 rpm por 15 minutos e coletar a fase aquosa.

8. Adicionar 0.1 volume de acetato de sódio 3M e 3 volumes de etanol absoluto pré-resfriado a -20 °C durante a noite.

9. Centrifugar a 12.000 rpm por 10 minutos sob centrifugação a 4 °C.

10. Lavar com 80% de etanol pré-resfriado duas vezes.

11. Ressuspender o pellet branco em uma quantidade apropriada de tampão TE ou ddH₂O. A solução resultante é o DNA celular.

Purificação e Concentração de DNA

• Precipitação de DNA com Etanol

1. Colocar a solução de DNA em um tubo de centrifuga e adicionar 0.1 volume de acetato de sódio 3M e 3 volumes de etanol absoluto pré-resfriado a -20 °C durante a noite.

2. Centrifugar a 14.000 rpm por 10 minutos a 4 °C e descartar o sobrenadante.

3. Lavar com 80% de etanol pré-resfriado duas vezes.

4. Ressuspender o pellet branco em uma quantidade apropriada de tampão TE ou ddH₂O. A solução resultante é o DNA celular.

O acetato de sódio fornece íons de sal para a precipitação do DNA, que pode ser adicionado um pouco mais e, finalmente, precisa ser removido. Parte do DNA é perdida durante o processo de purificação e concentração do DNA, e a recuperação do DNA é de aproximadamente 80%.

• Precipitação de DNA com Isopropanol

0.7 vezes o volume de isopropanol à temperatura ambiente é adicionado (por exemplo, 0.7 mL de isopropanol é adicionado a 1 mL do plasmídeo a ser concentrado). Após a mistura, a mistura é centrifugada a 14.000 rpm por 10 minutos a 4 °C, e o sobrenadante é cuidadosamente aspirado para evitar contato com o precipitado. Note que o DNA precipitado com isopropanol é um precipitado vítreo, quase transparente e granular que é difícil de ver em comparação com os precipitados contendo sal produzidos pela precipitação com etanol. Centrifugar o tubo de centrifuga o mais suavemente possível para evitar sedimentos soltos ou algumas partículas suspensas na solução. Não despejar o sobrenadante diretamente. Use uma pipeta para absorver suavemente o sobrenadante e tome cuidado para evitar aspiração.

Leituras Adicionais:

Diretrizes de Submissão de Amostras para Sequenciamento de Alto Rendimento

Recuperação de DNA Plasmidial de Culturas Bacterianas sem Uso de Kits

Referências:

1. Ayoib Adilah, Hashim Uda, Gopinath Subash C B et al. Extração de DNA em biochip: história e preeminência sobre métodos de extração convencionais e de fase sólida . Appl. Microbiol. Biotechnol, 2017, 101(22): 8077-8088.
2. Zielińska Sylwia, Radkowski Piotr, Blendowska Aleksandra et al. A escolha do método de extração de DNA pode influenciar o resultado da análise da estrutura da comunidade microbiana do solo. Microbiologyopen, 2017, 6(4).
3. Gerasimidis Konstantinos, Bertz Martin, Quince Christopher et al. O efeito da metodologia de extração de DNA nas aplicações de pesquisa sobre microbiota intestinal. BMC Res Notes, 2016, 9: 365.
4. Bitting Anna L, Bordelon Hali, Baglia Mark L et al. Dispositivo Automatizado para Extração Assíncrona de Biomarcadores de RNA, DNA ou Proteínas de Amostras de Pacientes Substitutas . J Lab Autom, 2016, 21(6): 732-742.
5. Casaril Aline Etelvina, de Oliveira Liliane Prado, Alonso Diego Peres et al. Padronização da extração de DNA de flebotomíneos: Aplicação à genotipagem por sequenciamento de próxima geração. Exp. Parasitol, 2017, 177: 66-72.