Sequenciação de RNA dual

O RNA-seq dual demonstrou monitorizar todas as classes de transcritos codificantes e não codificantes tanto do hospedeiro como do patógeno simultaneamente. A CD Genomics está a oferecer um serviço de RNA-seq dual de alta resolução, acessível e simples, para fornecer uma visão direta da interação entre hospedeiro e patógeno.

O que é Dual RNA-seq

Há uma ampla gama de interações entre espécies, como parasitismo, simbiose, competição, etc. O sequenciamento convencional do transcriptoma só pode estudar a informação de uma única espécie, o que não só desperdiça parte dos dados, mas também afeta a própria amostra durante a separação de duas espécies.

A tecnologia de sequenciamento Dual RNA-seq foi desenvolvida precisamente para abordar este tipo de questões. Ao construir apenas uma biblioteca de transcriptoma, o dual RNA-seq de RNA total misto após a depleção dupla de rRNA ou captura de poli(A) permite sequenciar e analisar duas (ou mais) espécies ao mesmo tempo, sem a necessidade de separar as espécies, revelando assim as mudanças dinâmicas na expressão génica entre elas. Entretanto, através do diagrama do modelo de interação, é possível obter a relação regulatória dos genes e o mecanismo de interação entre duas espécies; investigar a rede regulatória no processo de interação, o mecanismo de infecção por patógenos e a resistência do hospedeiro à doença; e investigar a relação evolutiva dos patógenos entre diferentes espécies, além de explorar a seleção positiva de genes relacionados com base em genes homólogos.

A CD Genomics pode lidar com vários modelos de invasão - patógenos envolvendo bactérias, fungos, protozoários, etc., o hospedeiro pode ser um mamífero ou uma planta. O nosso objetivo é fornecer serviços abrangentes de RNA-seq dual, desde o design experimental até à análise biocomputacional, para apoiar as suas necessidades de investigação.

Vantagens do Nosso Serviço de Dual RNA-seq

• Disponível para vários modelos de invasão
• Flexibilidade do tipo de amostra: RNA misto total, células hospedeiras infectadas, etc.
• A tecnologia de códigos de barras moleculares permite pequenas quantidades de template de entrada.
• Análise abrangente, alta estabilidade: Utilizando sequenciação na plataforma avançada Illumina, combinada com Computação de Alto Desempenho (HPC), para alcançar uma análise e entrega de dados de sequenciação rápidas e estáveis.
• Controlo de qualidade rigoroso, pipelines de análise diversificados: Implementação de medidas rigorosas de controlo de qualidade e oferta de pipelines de análise diversificados. Não apenas fornecendo análise de transcriptoma para espécies, mas também configurando análises avançadas como Análise de Rede de Co-expressão de Genes Ponderada (WGCNA), anotação de fatores de virulência, análise de rede de interacção proteína-proteína, etc., para explorar profundamente informações sobre relações interespécies.
• Design científico e meticuloso: Desde a seleção de amostras, preparação de bibliotecas, sequenciação até à análise de dados, cada etapa passa por um design científico e meticuloso para garantir resultados de pesquisa de alta qualidade.

Aplicações do Dual RNA-seq

• Doenças das plantas e mecanismos de resistência-susceptibilidade.
• Adaptação fisiológica e respostas moleculares.
• Patógenos e imunidade do hospedeiro.
• Simbiose interespécies e mecanismos evolutivos.
• Parasitismo na defesa de pragas e hospedeiros.
• Co-cultivo de bactérias/fungos.
• Pesquisa em doenças infeciosas.
• Genómica comparativa e mecanismos patogénicos.

Fluxo de trabalho do Dual RNA-seq

Após a preparação da sua amostra, a CD Genomics oferece um conjunto abrangente de serviços de sequenciação e análise bioinformática.

Especificação do Serviço

	Requisitos de Amostra: RNA total ≥ 1 μg, Concentração ≥ 10 ng/µL, OD260/280 = 1.8-2.0 Células ≥ 5×106 Tecido ≥ 500 mg, Quantidade Mínima: 100 mg
	Sequenciação: Plataforma Illumina Sequenciação PE150 12-24Gb
	Análise de Dados Análise do transcriptoma Análise de Rede de Co-expressão Gênica Ponderada (WGCNA) Anotação de fatores de virulência Análise da rede de interação proteína-proteína ...e mais

Pipeline de Análise

Pipeline genérico de análise de dados de RNA-seq dual (figura de V. Arluison et al., 2018)

Entregáveis

• Os dados de sequenciamento originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes em Dual RNA-seq para a sua escrita (personalização)

A sequenciação de RNA dual (Dual RNA-seq) é uma técnica de sequenciação de ponta desenvolvida para enfrentar tais desafios. Especializando-se na investigação de interações hospedeiro-patógeno, a CD Genomics utiliza uma análise avançada de dados de RNA dual-seq para impulsionar os avanços científicos nesta área. As nossas soluções personalizadas, a nossa experiência em bioinformática e o nosso compromisso inabalável com a qualidade garantem que os investigadores obtenham informações precisas, fiáveis e significativas sobre o intrincado mundo das interações hospedeiro-patógeno. Para mais informações sobre os nossos serviços, convidamo-lo a entrar em contacto connosco.

Referências:

1. Alexander J. Westermann, et al., O RNA-seq dual revela funções de RNA não codificante nas interações hospedeiro-patógeno. Natureza. 2016, vol. 000.
2. Alexander J. Westermann, et al., Resolvendo interacções hospedeiro-patógeno através de dual RNA-seq. PLoS Patógenos. 2017, 13(2).
3. Véronique Arluison e Claudio Valverde (eds.), RNA Reguladora Bacteriana: Métodos e Protocolos. Métodos em Biologia Molecular. 2018, vol. 1737.
4. Pisu et al., O sequenciamento de RNA dual de macrófagos infectados por Mtb in vivo revela interações hospedeiro-patógeno ontologicamente distintas. Relatórios Celulares. 2020, vol. 30.
5. Nuss A M, Beckstette M, Pimenova M, et al. O RNA-seq dual de tecidos permite a descoberta rápida de funções específicas de infecção e riborreguladores que moldam os transcriptomas hospedeiro-patógeno. Atas da Academia Nacional de Ciências, 2017, 114(5): E791-E800.

Resultados da Demonstração

Os resultados parciais estão mostrados abaixo:

Distribuição da qualidade de sequenciamento

Distribuição A/T/G/C

Interface do Navegador IGV

Análise de Correlação Entre Amostras

Gráfico de Pontuação PCA

Diagrama de Venn

Gráfico de Volcano

Resultados Estatísticos da Anotação GO

Classificação KEGG

Perguntas Frequentes sobre Dual RNA-seq

1. São necessários genomas de referência para todas as espécies que estão a ser submetidas a Dual RNA-seq?

Idealmente, a disponibilidade de genomas de referência para ambas as espécies interativas facilitaria resultados mais precisos. No entanto, a literatura também documenta procedimentos onde apenas uma única espécie tem um genoma de referência disponível. O fluxo de trabalho de análise nesses casos envolve inicialmente o mapeamento dos dados de sequenciação para a espécie com um genoma de referência. Os dados transcriptómicos, após a exclusão dos dados de mapeamento, podem ser analisados para obter informações sobre a outra espécie através do mapeamento com um parente próximo ou uma montagem de novo, facilitando análises subsequentes. Especificamente, para o segmento procariótico em uma amostra interativa, a presença de um genoma de referência é imperativa. No entanto, na sua ausência, o perfilamento do 'pan-genoma' bacteriano pode ser implementado.

2. Quais são as vantagens dos transcriptomas interativos em relação aos transcriptomas ordinários?

A sequenciação de RNA dual é uma técnica de sequenciação especializada concebida para investigar interações entre espécies, abrangendo geralmente relações simbióticas, parasitárias, competitivas e predatórias. Tradicional transcriptómica necessitar a separação destas espécies interativas, uma abordagem que, embora útil, pode levar à perda de informação pertinente e introduzir potenciais artefatos relacionados ao processo de segregação. Em forte contraste, está a abordagem de dual RNA-seq, que permite investigações simultâneas de duas ou mais espécies interativas sem a necessidade de sua partição. Consequentemente, isso contorna a possível influência prejudicial decorrente da separação das espécies. Além disso, esta metodologia é rentável, necessitando da construção de apenas uma biblioteca de transcriptoma, o que permite a análise simultânea de todas as espécies incluídas.

3. Quais são os diferentes tipos de RNA-seq?

Além disso, dependendo dos objetivos da pesquisa e das peculiaridades da amostra, o RNA-seq pode ser subdividido em vários tipos, tais como: RNA-seq total, mRNA-seq, miRNA-seq, Sequenciação de RNA não codificante longo, Sequenciação do Transcriptoma em Comprimento Total, RNA-seq circulare Inteiro RNA-seq do exoma.

Estudos de Caso de RNA-seq Dual

O RNA-Seq Dual Revela a Dependência Metabólica de Aminoácidos do Bactéria Intracelular Piscirickettsia salmonis a Infectar Salmão Atlântico

Revista: Frontiers in Microbiology
Fator de impacto: 6,064
Publicado: 27 de novembro de 2018

Resumo

Sequenciação de alto rendimento tecnologias, aplicadas à investigação transcriptómicaRNA-Seq), abriram a possibilidade de compreender reações moleculares complexas dentro de diferentes contextos biológicos. Recentemente, o sequenciamento síncrono dos transcriptomas de um patógeno e do hospedeiro durante a infecção - conhecido como dual RNA-seq - emergiu como um método promissor para desvendar as complexidades das interações hospedeiro-patógeno. Neste estudo em particular, através da depleção de rRNA dual e do esquema de sequenciamento de RNA, os investigadores analisaram simultaneamente os transcriptomas da bactéria intracelular. Piscirickettsia em salmão e nas suas espécies hospedeiras, Salmão do Atlântico, ao longo do curso da infeção.

Métodos

Resultados

Exploração do Transcriptoma do Hospedeiro e do Patógeno Durante a Patogénese

A análise de RNA-Seq dual delineou a regulação dos transcriptomas de P. salmonis e S. salar durante o curso da infeção. Relativamente ao transcriptoma de S. salar, 771 e 829 genes foram expressos diferencialmente no baço aos 7 e 14 dpi, respetivamente (Fig 1B). Simultaneamente, 412 e 467 genes foram regulados diferencialmente nesses mesmos pontos temporais no rim cefálico. Os genes especificamente modulados no rim cefálico incluíram aqueles que codificam proteínas da família MATE, a proteína de reparo de DNA RecN, a proteína chaperona HtpG e várias proteínas de membrana (Fig 2). Entre os genes partilhados, foram identificados diferentes fosfatases de proteínas 1, proteínas ribossómicas, chaperonas moleculares e subunidades do transamidossoma Asn/Gln (Fig 2).

FIGURA 1. (A) Análise global do transcriptoma de Piscirickettsia salmonis (azul) e S. salar (vermelho) aos 3, 7 e 14 dias pós-infecção (dpi) nos tecidos do baço e do rim cefálico. Os valores de expressão foram estimados como transcritos por milhão de leituras (TPM) e transformados em Log2 para o agrupamento do mapa de calor. (B) Genes diferencialmente expressos no baço e no rim cefálico aos 7 e 14 dpi, usando como controle os valores de expressão aos 3 dpi. Os três dias pós-infecção foram utilizados como expressão gênica de referência, uma vez que não haveria leituras bacterianas presentes em qualquer tipo de grupo de controle.

FIGURA 2. Diagrama de Venn mostrando o número de genes exclusivos e partilhados no transcriptoma de P. salmonis durante a infeção nos tecidos do baço (azul) e do rim cefálico (vermelho) do salmão atlântico. Os mapas de calor mostram um subconjunto de genes exclusivos e partilhados expressos por P. salmonis em ambos os tecidos.

Metabolismo de Aminoácidos: Uma Resposta Comum Entre P. salmonis e S. salar

A análise de enriquecimento GO indicou que uma grande proporção dos genes diferencialmente expressos em P. salmonis estiveram associados a processos metabólicos de proteínas e compostos de nitrogénio. A enriquecimento de genes relacionados com o metabolismo de proteínas também foi descoberto através da anotação KEGG. No entanto, apesar de o metabolismo de aminoácidos não ser a principal resposta transcriptómica dentro do hospedeiro, ambos P. salmonis e S. salar demonstrou numerosos genes ligados à síntese biológica e degradação de aminoácidos.

FIGURA 3. Anotação de ontologia genética (A) e anotação de via KEGG (B) dos genes diferencialmente expressos em Salmão do Atlântico e P. salmonis durante a infeção.

Conclusão

Além das respostas imunes padrão do hospedeiro e dos fatores de virulência dos patógenos, tanto as bactérias quanto o hospedeiro exibem uma profusão de genes associados a processos metabólicos, em particular, aqueles relacionados ao metabolismo de aminoácidos. As nossas descobertas apontam para uma dependência de P. salmonis sobre o metabolismo dos aminoácidos de S. salar, o que poderia sugerir um novo mecanismo de patogénese baseado na capacidade de absorver nutrientes do hospedeiro. Em termos gerais, o sequenciamento de transcriptoma dual permite uma perspetiva variada sobre a interação entre hospedeiro e patógeno, transcendendo os processos biológicos entrelaçados com a imunidade.

Referência:

1. Valenzuela-Miranda D, Gallardo-Escárate C. O RNA-Seq dual revela a dependência metabólica de aminoácidos da bactéria intracelular Piscirickettsia salmonis que infecta o salmão atlântico. Fronteiras em microbiologia, 2018, 9: 418416.