Serviço de Sequenciação de microRNA

O que é o sequenciamento de microRNA

microRNA (miRNA) é uma classe de RNA não codificante pequeno endógeno em eucariotos, com um comprimento de aproximadamente 17 a 25 pares de bases. Desde a descoberta do miRNA em 1993, os avanços e descobertas no campo dos pequenos RNAs revolucionaram a compreensão da regulação genética na comunidade científica. Desde o desenvolvimento embrionário até a apoptose celular e até mesmo o crescimento tumoral, o miRNA desempenha um papel crucial numa variedade de processos fisiológicos e patológicos. Vários miRNAs associados à genética, metabolismo, doenças infecciosas e tumores fornecem aos cientistas novas perspetivas para a investigação patológica e podem servir como biomarcadores fiáveis para doenças. Os cientistas estão a explorar ativamente intervenções e tratamentos terapêuticos para doenças manipulando as funções do miRNA e desenvolvendo novos métodos de entrega in vivo. Além disso, descobriu-se que o miRNA medeia a evolução e adaptação entre espécies, e ainda há muito mais para explorar em relação ao miRNA.

miRNA-seq é uma sequenciação de alto rendimento método desenvolvido para detectar a expressão de miARNs. Drosha e Dicer, que estão envolvidos no processamento de miARN, pertencem à família de nucleases RNase III. Assim, os miARNs possuem um grupo 5' -PO4 e um grupo 3' -OH, que podem ser utilizados diretamente para reações de ligação. Além disso, os miARNs são caracterizados por comprimentos de 18-30 nucleotídeos. Assim, ao ligar diretamente o RNA total e recuperar os fragmentos inseridos com comprimentos variando de 18 a 30 nucleotídeos, os miARNs podem ser enriquecidos, bibliotecas podem ser construídas e a expressão dos miARNs pode ser analisada.

O nosso Serviço de Sequenciação de miRNA:

A CD Genomics aplica-se sequenciação de alto rendimento tecnologia para sequenciar bibliotecas de microRNA. Esta tecnologia permite a aquisição de milhões de sequências de microRNA em uma única corrida, possibilitando a identificação rápida de microRNAs conhecidos e desconhecidos e suas diferenças de expressão em diferentes espécies, tecidos, estágios de desenvolvimento e estados de doença. Além disso, o sequenciação de próxima geração A tecnologia tem aplicações significativas na deteção de cadeias complementares de microRNA, edição de microRNA, deteção de isoformas de microRNA, previsão de novos microRNA e análise de genes-alvo de microRNA. Ela fornece uma ferramenta poderosa para estudar o papel dos microRNAs nos processos celulares e os seus impactos biológicos.

Os serviços de sequenciação de microRNA da CD Genomics incluem a quantificação de RNA total ou amostras de microRNA fornecidas pelo cliente, seguidas pela construção da biblioteca de microRNA, geração de clusters e sequenciação. O serviço de sequenciação de microRNA da CD Genomics oferece serviços abrangentes e integrados, desde a extração da amostra até à análise de dados. O serviço inclui controlo de qualidade da extração da amostra, preparação da biblioteca, sequenciação, análise bioinformática e relatório de dados.

Vantagens do Nosso Serviço de Sequenciação de miRNA

• Alta Sensibilidade: Teoricamente capaz de detectar uma única cópia de microRNA.
• Alta Precisão: Capaz de detectar diferenças de uma única base em microRNA.
• Não afetado pela interferência de informações anteriores, capaz de identificar microARNs conhecidos e descobrir novos.
• Preserva a informação direcional para a análise de expressão específica de fitas.
• Utiliza códigos de barras para analisar economicamente múltiplas amostras numa única corrida.
• Maior sensibilidade e menor viés.
• Utiliza códigos de barras moleculares e etiquetas digitais para corrigir duplicados falsos positivos introduzidos pela PCR e sequenciação.
• Equipa de bioinformática forte a fornecer resultados de análise abrangentes.

Aplicações do Sequenciamento de miRNA

• Uso Independente: Estudo da expressão de miARNs durante processos biológicos.
• Uso Autónomo: Pesquisa de biomarcadores de miRNA em fluidos biológicos como soro, plasma e exossomas.
• Uso Combinado com mRNA-seqConstrução de redes regulatórias miRNA-mRNA durante processos biológicos.
• Uso Combinado com circRNA-seqConstrução de redes regulatórias miRNA-circRNA.
• Integração Multi-ômica: Construção de redes regulatórias circRNA-miRNA-mRNA.

Fluxo de Trabalho de Sequenciação de miRNA

Especificação de Serviço

	Requisitos de Amostra RNA total ≥ 5 µg, Concentração ≥ 200 ng/µl Relação OD A260/A280 ≥ 1,8, relação A260/230 ≥ 1,8, RIN ≥ 6 Todas as amostras de RNA total devem estar livres de DNA. O RNA deve ser armazenado em água livre de nucleases ou em RNA Stable. Nota: Os montantes de amostra são indicados apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.
Clique	Estratégias de Sequenciamento Bibliotecas de miRNA (15-30nt), RNA pequeno (30-200nt) ou intervalo de tamanho personalizado. Illumina HiSeq SE50 ≥ 10 M leituras Mais de 90% das bases com um escore de qualidade ≥Q30
	Análise de Dados Fornecemos múltiplas análises de bioinformática personalizadas: Controlo de qualidade de dados brutos e filtro de comprimento Mapeamento baseado em referência Classificação e quantificação de RNA pequeno Predição e anotação de genes-alvo Predição de pequenos RNAs novos Análise de genes-alvo de pequenos RNAs diferencialmente expressos (enriquecimento GO e enriquecimento KEGG) Nota: Os dados recomendados e os conteúdos de análise apresentados são apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes na Sequenciação de microRNA para a sua escrita (personalização)

A CD Genomics oferece serviços especializados de sequenciação de microRNA, abrangendo controlo de qualidade de amostras, construção de bibliotecas, sequenciação profunda e análise rigorosa de dados. A nossa abordagem personalizada garante resultados precisos alinhados com as suas necessidades de investigação. Contacte-nos para mais informações sobre como podemos apoiar os seus objetivos de investigação.

Os resultados parciais estão mostrados abaixo:

Distribuição da qualidade de sequenciamento

Distribuição A/T/G/C

Interface do Navegador IGV

Análise de Correlação Entre Amostras

Gráfico de Pontuação PCA

Diagrama de Venn

Gráfico de Volcano

Resultados Estatísticos da Anotação GO

Classificação KEGG

1. Por que escolher realizar sequenciação de microRNA?

A sequenciação de microRNA permite um perfil abrangente dos níveis de expressão de todos os microRNAs em células ou tecidos, incluindo microRNAs de baixa abundância e raros. Comparado a métodos tradicionais como RT-qPCR, oferece maior sensibilidade e cobertura. Isto é crucial para estudar as relações entre microRNAs e doenças, processos biológicos e respostas a fármacos.

2. Qual é o processo de construção da biblioteca para sequenciação de microRNA?

O microRNA (miRNA) difere do RNA mensageiro (mRNA), do RNA longo não codificante (lncRNA) e do RNA circular (circRNA) em termos das suas sequências curtas. Assim, durante a construção da biblioteca, as características únicas das sequências de miRNA são diretamente utilizadas através da adição de adaptadores, seguidas de transcrição reversa e amplificação. Subsequentemente, os adaptadores de sequenciação são adicionados através da amplificação por PCR, seguida da purificação em gel de fragmentos de DNA específicos. Em seguida, a biblioteca passa por sequenciação na máquina. Devido ao distinto processo de construção da biblioteca, a deteção simultânea de miRNA e mRNA requer a construção de bibliotecas separadas. Isto porque a seleção de segmentos no processo de construção da biblioteca relacionada com mRNA, lncRNA e circRNA filtra fragmentos de RNA pequenos.

3. O que é a sequência de semente do miRNA?

A sequência de semente de uma molécula de miRNA refere-se a um segmento crucial tipicamente composto por 2 a 8 nucleotídeos. Localizada na extremidade 5' da molécula de microRNA, esta sequência desempenha um papel fundamental na ligação à região 3' UTR de genes-alvo. Ao emparelhar-se de forma complementar com o gene-alvo através da sua sequência de semente, o miRNA modula a expressão gênica.

4. Quanto tempo demora o sequenciamento de microRNA?

O comprimento da sequenciação de microRNA varia dependendo da plataforma de sequenciação e do desenho experimental utilizado. Geralmente, as leituras geradas na sequenciação de microRNA variam tipicamente de 18 a 50 nucleotídeos, sujeitas às limitações técnicas do instrumento de sequenciação e aos objetivos específicos do experimento de sequenciação.

5. Quais são os métodos para detetar miRNA?

Os métodos de deteção para miRNA incluem Sequenciamento Profundo, Micro-Array e qPCR em tempo real. O Sequenciamento Profundo é uma tecnologia de ponta. sequenciação de alto rendimento tecnologia que permite uma análise abrangente, profunda e detalhada de uma entidade biológica, tecido ou componente celular ao nível do genoma, transcriptoma ou metaboloma. Através da tecnologia de Sequenciamento Profundo, miARNs desconhecidos podem ser explorados e descobertos, e miARNs conhecidos podem ser analisados preliminarmente de forma qualitativa e semi-quantitativa. Microarranjo a tecnologia oferece vantagens de alta capacidade de processamento e custo-efetividade, mas tem capacidades limitadas de diferenciação de expressão. A qPCR em tempo real é o método de quantificação de miRNA mais sensível e preciso para determinar o número de cópias de DNA (ou cDNA) numa amostra.

6. Quais são as vantagens do sequenciamento de microRNA em comparação com o RT-qPCR tradicional?

A sequenciação de microRNA possui vantagens significativas em relação à RT-qPCR tradicional: detecta de forma abrangente todos os microRNAs conhecidos e potenciais, incluindo aqueles com níveis de expressão baixos; facilita o processamento de alto rendimento de múltiplas amostras, aumentando assim a eficiência do trabalho e a consistência dos dados; além disso, oferece análises bioinformáticas detalhadas, incluindo análises de expressão diferencial e enriquecimento funcional, ajudando a uma compreensão mais profunda dos papéis e mecanismos dos microRNAs em processos biológicos.

biomarcadores de miRNA para prever os resultados de sobrevivência global em carcinoma espinocelular da cabeça e pescoço

Revista: Genómica
Fator de impacto: 6,205
Publicado: 2020

Fundo

O carcinoma espinocelular da cabeça e pescoço (HNSCC) é um tumor maligno do trato digestivo superior. Alterações na função de miRNA podem promover o desenvolvimento do câncer através de vários mecanismos. Este estudo utilizou Sequenciação de RNA (RNA-seq) e dados de sequenciação de miRNA da base de dados TCGA para demonstrar o microambiente de miRNA desregulado e fornecer biomarcadores valiosos para a terapia com miRNA. No conjunto de treino, sete miRNAs foram identificados como fatores prognósticos independentes para pacientes com HNSCC. Estes miRNAs, em conjunto, direcionaram 60 genes, dos quais nove genes-alvo (CDCA4, CXCL14, FLNC, KLF7, NBEAL2, P4HA1, PFKM, PFN2 e SEPPINE1) estavam associados à sobrevivência global (OS) dos pacientes. Este estudo identificou novos marcadores de miRNA para prever o prognóstico do carcinoma espinocelular da cabeça e pescoço.

Materiais e Métodos

Resultados

1. Aquisição de Dados

Os dados de RNA-seq e miRNA-seq de pacientes com HNSCC foram descarregados da base de dados TCGA. A base de dados miRBase contém sequências e anotações conhecidas de miRNA, incluindo informações sobre a localização e sequência de miRNAs maduros. As sequências em formato Fasta de todas as sequências de miRNA maduro obtidas da miRBase foram utilizadas para a anotação de miRNA. Os dados de RNA-seq e miRNA-seq foram extraídos de amostras de 529 indivíduos (42 normais e 487 tumorais) e 552 indivíduos (44 normais e 508 tumorais), respetivamente. Os dados clínicos e patológicos coletados simultaneamente incluíam género, idade, estadiamento, classificação TNM, estado de sobrevivência e dias de sobrevivência.

2. Estabelecimento de Prognóstico Baseado em miRNA

Marcadores Um total de 1.075 mRNAs diferencialmente expressos (581 regulados para cima e 494 regulados para baixo) e 313 miRNAs diferencialmente expressos (203 regulados para cima e 110 regulados para baixo) foram obtidos a partir da análise de dados ómicos do TCGA. As Figuras 1A-1B mostram os mapas de calor e os gráficos de vulcão dos 20 principais mRNAs diferencialmente expressos regulados para cima/para baixo, enquanto as Figuras 1C-1D mostram os mapas de calor e os gráficos de vulcão dos 20 principais miRNAs diferencialmente expressos regulados para cima/para baixo. Para selecionar miRNAs prognósticos, os miRNAs de expressão diferencial foram avaliados usando a análise de Cox univariada. Na análise de Cox univariada, foram identificados 26 miRNAs importantes com alterações significativas, dos quais sete miRNAs diferencialmente expressos (hsa-miR-499a-5p, hsa-miR-99a-5p, hsa-miR-337-3p, hsa-miR-4746-5p, hsa-miR-432-5p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-137-3p) foram identificados como fatores prognósticos independentes para pacientes com HNSCC. Portanto, a fórmula para o modelo neste estudo é: Pontuação de Risco = (0.238 × hsa-miR-337-3p) + (0.246 × hsa-miR-99a-5p) - (0.232 × hsa-miR-4746-5p) - (0.233 × hsa-miR-432-5p) - (0.261 × hsa-miR-142-3p). Além disso, as pontuações de risco para cada paciente na coorte do estudo foram calculadas. Em seguida, a pontuação de risco mediana foi utilizada como valor de limiar para dividir os pacientes em grupos de alto risco e baixo risco no conjunto de treino, conjunto de teste e todos os pacientes.

Fig. 1. O gráfico de volcano e o mapa de calor dos 20 principais genes ou miARNs diferencialmente expressos, regulados para cima/para baixo. A-B: mRNA; C-D: miARNs.

3. Resultados de Sobrevivência e Análise Multivariada

Neste estudo, a expressão de sete miARNs na sobrevivência dos pacientes foi analisada utilizando curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier. Foi encontrado que hsa-miR-499a-5p, hsa-miR-99a-5p, hsa-miR-337-3p, hsa-miR-4746-5p, hsa-miR-432-5p, hsa-miR-142-3p e hsa-miR-137-3p influenciaram significativamente os resultados de sobrevivência global (SG) (Figuras 2A-G). Adicionalmente, as curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier para os dois conjuntos de dados foram utilizadas para avaliar o valor preditivo dos sete miARNs. Tanto no conjunto de treino como no conjunto de teste, os pacientes no grupo de alto risco apresentaram taxas de sobrevivência mais baixas do que aqueles no grupo de baixo risco. Foi realizada uma análise da curva ROC para determinar se os padrões de expressão dos miARNs associados à sobrevivência poderiam fornecer uma previsão precoce da ocorrência de HNSCC. Os resultados mostraram uma AUC de 0,716 para o conjunto de treino e uma AUC de 0,654 para o conjunto de teste, indicando sensibilidade e especificidade moderadas do modelo prognóstico. O gráfico do estado de sobrevivência de risco demonstrou que, à medida que a pontuação de risco do paciente aumentava, a taxa de mortalidade também aumentava (Figura 3). Para estabelecer um modelo prognóstico baseado nos sete miARNs, foram realizadas análises de Cox univariadas e multivariadas para identificar fatores de risco. Os resultados revelaram que, com base nas sete características de miARN, o género e o estágio N eram fatores prognósticos independentes para a SG (Figura 4).

Fig. 2. Análise de sobrevivência global de 7 miRNA, o conjunto de treino e o conjunto de teste. A-G: miRNAs; H: Conjunto de treino; I: Conjunto de teste.

Fig. 3. Os resultados das curvas ROC e o gráfico do estado de sobrevivência do paciente no conjunto de treino e no conjunto de teste. A: ROC no conjunto de treino; B: ROC no conjunto de teste; C: Estado de sobrevivência no conjunto de treino; D: Estado de sobrevivência no conjunto de teste.

Fig. 4. Análise COX univariada e multivariada para identificar os fatores de risco. A: Univariada; B: Multivariada.

4. Análise de Genes Alvo de miRNA

A previsão de genes-alvo para estes sete miARNs resultou em 60 genes-alvo obtidos de bases de dados online. As potenciais conexões entre os miARNs e os genes-alvo foram exploradas utilizando o Cytoscape. Como mostrado na Figura 5, hsa-miR-137-3p foi o maior nó na rede, enquanto hsa-miR-99a-5p e hsa-miR-4746-5p não tinham genes-alvo correspondentes (os nós vermelhos representam regulação positiva, os nós verdes representam regulação negativa). Para avaliar as funções biológicas destes genes-alvo, foram realizadas análises de enriquecimento GO e de vias KEGG. A análise GO revelou o enriquecimento de genes-alvo em processos biológicos (BP) como regulação negativa de processos celulares, desenvolvimento de tecidos e resposta a fatores inibitórios. As funções moleculares (MF) foram enriquecidas em constituinte estrutural da matriz extracelular, ligação a fatores de crescimento, ligação à actina e atividade de fosfatase de tirosina/serina/treonina. Os componentes celulares (CC) foram principalmente enriquecidos em grânulos alfa de plaquetas, cinetócoro de cromossomos condensados, matriz extracelular e outros termos. A análise de vias KEGG indicou que estes genes-alvo estavam principalmente enriquecidos na via da fosfato de pentose, metabolismo da galactose e vias de glicólise/gliconeogénese (Figura 6).

Fig. 5. O Cytoscape explorou a ligação potencial entre microRNA e genes-alvo.

Fig. 6. Os resultados da análise GO e da análise KEGG dos genes-alvo.

5. Relação entre miRNA

Genes Alvo e Resultado de Sobrevivência Analisando o impacto da expressão dos genes alvo de miRNA na sobrevivência dos pacientes, foi encontrado que a expressão de nove genes: CDCA4, CXCL14, FLNC, KLF7, NBEAL2, P4HA1, PFKM, PFN2 e SEPPINE1, influenciou significativamente a sobrevivência global (OS) (Figuras 7A-7I). A construção de uma rede de interação proteína-proteína (PPI) revelou dois genes-chave centrais, PDGFRB e RAD51 (Figura 7J).

Fig. 7. Análise de sobrevivência global dos genes-alvo identificados e da rede de interação proteína-proteína (PPI). A-I: mRNA; J: rede PPI.

Conclusão

Este estudo, baseado no conjunto de dados do TCGA, identificou uma característica inovadora de miRNA e analisou o prognóstico do HNSCC. A pesquisa fornece novas perspetivas para o desenvolvimento de ferramentas fiáveis para a previsão precisa dos resultados do tratamento do câncer. No entanto, as limitações deste estudo incluem a falta de validação em amostras clínicas e um tamanho de amostra relativamente pequeno, o que pode limitar o poder estatístico. Os marcadores moleculares identificados devem ser validados em mais estudos independentes e em experiências funcionais.

Referência:

1. Wu Z H, Zhong Y, Zhou T, et al.Biomarcadores de miRNA para prever os resultados de sobrevivência global em carcinoma espinocelular da cabeça e pescoço. Genómica, 2021, 113(1): 135-141.