Diretrizes para Submissão de Amostras
Introdução
A compreensão do microbioma é central para a investigação em saúde humana, desenvolvimento de medicamentos, agricultura e ciência ambiental. No entanto, a maioria dos estudos sobre o microbioma ainda depende de sequenciação metagenómica relativa, que mede a composição proporcional em vez da verdadeira carga microbiana. Esta abordagem composicional pode distorcer a dinâmica microbiana, mascarar diferenças entre amostras e limitar a interpretação biológica.
Nosso Serviço de Sequenciação Metagenómica Absoluta supera estas limitações ao combinar metagenómica de leitura longa com estratégias de quantificação absoluta. Ao integrar padrões internos e controlos de spike-in, fornecemos contagens microbianas precisas por amostra, permitindo comparações fiáveis entre estudos e avaliações quantitativas de risco. Este serviço é projetado para instituições académicas, laboratórios de bioquímica e projetos de CRO que requerem insights confiáveis sobre o microbioma além da abundância relativa
Por que Sequenciação Metagenómica Absoluta?
O perfil de abundância relativa convencional força as comunidades microbianas a serem expressas em percentagens que sempre somam um. Um aumento numa espécie pode parecer diminuir outra, mesmo quando ambas estão a crescer, levando a correlações enganosas e conclusões falsas. Para os investigadores que estão a estudar interacções droga-microbioma, microbiologia ambiental, ou genes de resistência a antibióticos (ARGs), tal viés pode comprometer criticamente os resultados.
Sequenciação metagenómica absoluta resolve este problema medindo o verdadeira abundância de táxons microbianos e genes funcionaisEsta abordagem permite:
- Avaliação precisa da carga microbiana – detetar aumentos ou diminuições reais em táxons sem viés composicional.
- Comparabilidade entre amostras e estudos – normalize os resultados para contagens absolutas, não frações relativas.
- Avaliação quantitativa do risco microbiano – avaliar patógenos e ARGs em termos do número real de cópias por volume.
- Interpretação biológica aprimorada – vincular mudanças microbianas à resposta do hospedeiro, tratamento medicamentoso ou alteração ambiental com maior confiança.
Ao integrar perfilagem do microbioma de abundância absoluta com sequenciação de leitura longaA CD Genomics oferece ambos resolução e fiabilidadeajudando os clientes a passar de estimativas relativas para verdadeiros insights.
Comparação: Abundância Relativa vs. Abundância Absoluta
| Recurso | Abundância Relativa | Abundância Absoluta |
|---|---|---|
| Tipo de Medida | Proporcional (% do total) | Contagens reais (células, cópias de genes por volume ou massa) |
| Dependência | DNA total da comunidade, profundidade de sequenciação, efeitos composicionais | Calibrado através de spike-in, carga microbiana total, menos afetado por viés composicional. |
| Risco de Correlação | Alto risco de correlações espúrias; efeitos de dominância distorcem interpretações. | Mudanças mais diretas e interpretáveis; permite a deteção confiante de mudanças reais. |
| Comparabilidade entre amostras cruzadas / estudos cruzados | Pobre, uma vez que as contagens totais de leitura ou a composição da comunidade variam amplamente. | Melhor, porque a normalização para unidades absolutas permite uma comparação direta entre condições e estudos. |
| Cenários de Aplicação | Bom para entender a estrutura da comunidade, diversidade e proporções. | Melhor para avaliação de risco, monitorização da carga de patógenos, abundância de ARG e efeitos do tratamento com medicamentos. |
Guia de Comparação e Seleção de Plataformas
| Plataforma | Principais Forças | Limitações | Melhores Casos de Uso |
|---|---|---|---|
| Nanoporosidade | Leituras ultra-longas (dezenas de kb a >1 Mb), streaming de dados em tempo real; deteção direta de modificações de bases; excelente para capturar genomas completos, plasmídeos, elementos móveis; fluxos de trabalho portáteis. | A precisão da leitura bruta é inferior à do "HiFi" PacBio ou da Illumina de alta cobertura; mais erros de sequenciação, especialmente em regiões homopoliméricas; pode exigir maior profundidade ou polimento. | Quando precisa de leituras ultra-longas para variação estrutural, rastreamento de hospedeiros ARG, implantação rápida/campo, ou quando deseja perfilar modificações epigenéticas. |
| PacBio (HiFi / SMRT) | Combina leituras longas com alta precisão de molécula única (HiFi), forte em regiões repetitivas, deteção de variantes estruturais e montagens de alta qualidade; taxas de erro mais baixas após o consenso. | Custo mais elevado por base; tempo de resposta mais longo e custo do instrumento; pode precisar de mais DNA de entrada de alta qualidade; capacidade de streaming em tempo real inferior em comparação com o Nanopore. | Para projetos que necessitam de genomas de referência de alta qualidade, alta precisão de base, regiões complexas ou validação/polimento de montagens de leituras longas; trabalho de metilação/epigenética. |
| Illumina / Sequenciação de Segunda Geração | Muito alta precisão por base; excelente rendimento; custo mais baixo por Gb; pipelines bem estabelecidos; ideal para sequenciação de fragmentos curtos, grandes quantidades de amostras. | Leituras curtas dificultam a montagem de repetições, plasmídeos, elementos móveis e a ligação de hospedeiros de ARG; não há deteção direta de modificações de bases; apenas abundância relativa, a menos que seja utilizada com spike-in ou calibração da carga microbiana. | Quando é necessário um elevado rendimento de amostras, sensibilidade ao custo, estudos comparativos; ou para polir montagens a partir de dados de leitura longa; para estimativa de diversidade, deteção de SNP, quantificação de genes. |
Como Escolher a Plataforma Certa
- Se a sua prioridade é a resolução estrutural / ligação de hospedeiros ARG / montagem de plasmídeos / modificações epigenéticas, opte pelo Nanopore ou PacBio.
- Se precisar de alta precisão base, especialmente para SNPs ou deteção de variantes raras, o PacBio HiFi ou o Illumina (ou uma abordagem híbrida) podem ser preferíveis.
- O orçamento, a quantidade e qualidade do DNA, e o tipo de amostra influenciam a escolha: plataformas de leitura longa geralmente necessitam de DNA de maior peso molecular.
- Frequentemente, a estratégia híbrida (leituras longas + leituras curtas / polimento) oferece o melhor de dois mundos.
O Nosso Fluxo de Trabalho de Sequenciação Metagenómica Absoluta
A CD Genomics oferece uma solução completa. fluxo de trabalho de sequenciação metagenómica absoluta alimentado por tecnologia de leitura longaO nosso processo simplificado garante uma quantificação microbiana precisa, montagens de alta qualidade e resultados acionáveis para clientes de investigação.
Passo 1. Coleta de Amostras e Avaliação da Qualidade
- Suporte para diversos tipos de amostras: fezes, saliva, águas residuais, solo, água do mar, biorreator e ambientes extremos.
- QC inicial para garantir a integridade do DNA e uma carga microbiana suficiente para análises posteriores.
Passo 2. Extração de DNA e Controlo de Spike-In
- Extração de DNA microbiano de alta qualidade com mínima contaminação do hospedeiro.
- Incorporação de padrões celulares ou sintéticos para calibrar dados de sequenciação e permitir a profilagem absoluta da abundância do microbioma.
Passo 3. Preparação da Biblioteca e Sequenciação
- Preparação de biblioteca otimizada adaptada a metagenomas complexos.
- Sequenciação Nanopore/Pacbio nas mais recentes plataformas, gerando leituras ultra-longas para a montagem completa de genomas microbianos e plasmídeos.
Passo 4. Processamento e Montagem de Dados
- Controlo de qualidade rigoroso das leituras brutas.
- Montagem e agrupamento de genomas montados a partir de metagenomas (MAGs) e plasmídeos.
- Classificação taxonómica até ao nível de espécie e estirpe.
Passo 5. Anotação Funcional e Perfilagem de ARG/Virulência
- Anotação de genes funcionais e vias metabólicas (KEGG, GO, eggNOG).
- Deteção de genes de resistência a antibióticos (ARGs) e fatores de virulência, com rastreamento do hospedeiro possibilitado por leituras longas.
- Análise de modificação de base opcional (6mA, 5mC).
Passo 6. Análise e Relatório de Abundância Absoluta
- Conversão de dados de sequenciação em contagens absolutas por volume de amostra utilizando calibração com spike-in.
- Relatórios de dados abrangentes, incluindo tabelas de abundância relativa e absoluta, insights funcionais e visualizações personalizadas.
- Entrega de resultados prontos para publicação para investigação, projetos de CRO e estudos académicos.
Aplicações
Investigação do microbioma humano e animal – perfilagem do microbioma de abundância absoluta para comunidades intestinais, orais e cutâneas
Estudos de interação entre fármacos e microbioma – avaliar os efeitos terapêuticos e a segurança através do sequenciamento metagenómico absoluto
Monitorização da resistência a antibióticos – Detecção de ARG e rastreio de hospedeiros em amostras clínicas e ambientais
Epidemiologia baseada em águas residuais (EBAR) – vigilância rápida de patógenos e genes de resistência em sistemas de água
Microbiologia ambiental – metagenómica de solos, ambientes marinhos e extremos para estudos de ecologia e biodiversidade
Microbiologia industrial e monitorização de bioprocessos – rastrear a composição microbiana e os genes funcionais em sistemas de produção
Por que a CD Genomics?
Escolher o parceiro certo para sequenciação metagenómica absoluta é crítico para obter resultados fiáveis e acionáveis. A CD Genomics destaca-se com vantagens únicas que vão além dos fornecedores de sequenciamento padrão.
Experiência comprovada em metagenómica de leitura longa
Mais de uma década de experiência na prestação de serviços de sequenciação de Long-read de alta qualidade, desde leituras ultra-longas até soluções de transcriptoma direcionadas e de comprimento total.
Capacidade de quantificação absoluta
Ao contrário de muitos concorrentes que relatam apenas a abundância relativa, nós integramos padrões de spike-in e calibração avançada para fornecer medidas verdadeiras da carga microbiana.
Entregáveis abrangentes
De tabelas de abundância absoluta do microbioma para montagens de genoma, rastreamento de hospedeiros de ARG e perfilagem de modificação de bases, fornecemos uma visão completa das comunidades microbianas.
Suporte entre aplicações
A experiência em saúde humana, investigação sobre fármacos e microbioma, monitorização ambiental e microbiologia industrial garante soluções personalizadas para cada cliente.
Gestão de projetos de ponta a ponta
Desde a preparação de amostras até à bioinformática avançada e interpretação, oferecemos serviços de balcão único que poupam tempo e recursos aos clientes.
Parceiro CRO global de confiança
Servindo instituições académicas de topo, empresas farmacêuticas e firmas de biotecnologia em todo o mundo com qualidade consistente e apoio profissional.
A CD Genomics oferece não apenas dados de sequenciação, mas insights acionáveis sobre o microbioma—ajudando os nossos clientes a passar com confiança de dados brutos a descobertas significativas.
Requisitos de Amostra
| Tipo de Amostra | Quantidade Recomendada | Quantidade Mínima | Concentração | Notas |
|---|---|---|---|---|
| DNA genómico | ≥ 5 µg | — | ≥ 20 ng/µL | DNA de alto peso molecular, OD260/280 = 1,8–2,0 |
| DNA metagenómico de leitura longa | ≥ 2 µg | — | ≥ 30 ng/µL | O DNA deve estar livre de RNase, sem degradação/contaminação. |
| Amostras Ambientais | 6 g | 2 g | — | Solo, lodo, sedimento aceites |
| Membrana de Filtro de Água | 6 | 2 | — | Membranas de 0,22 µm recomendadas para captura microbiana |
| Tecido | 2 g | 1 g | — | Fresco ou congelado, congelamento rápido em azoto líquido. |
| Líquido Intersticial | 6–10 mL | 2 mL | — | Armazenar congelado, enviar em gelo seco |
Entregáveis
- Dados de sequenciação bruta com relatório de QC
- Perfilagem taxonómica com tabelas de abundância relativa e absoluta
- Assemblagens de genomas e plasmídeos de alta qualidade (MAGs)
- Anotação funcional de genes e vias (KEGG, GO, eggNOG)
- Deteção de ARG e fatores de virulência com rastreamento de hospedeiros
- Perfil de modificação de base opcional (6mA, 5mC)
- Relatório de projeto abrangente com figuras prontas para publicação
Perguntas Frequentes
Q: Qual é a diferença entre abundância relativa e abundância absoluta em sequenciação metagenómica?
A abundância absoluta refere-se à medição do número real de células microbianas, genes ou táxons por unidade de amostra (por exemplo, por grama, por mL), o que evita interpretações enganosas que surgem quando os dados são expressos apenas como proporções; a abundância relativa mostra apenas percentagens de todos os organismos detectados, portanto, se um táxon aumenta, outro deve diminuir, mesmo que o seu próprio nível absoluto permaneça constante.
P: A sequenciação pode fornecer resolução a nível de estirpe e identificar os hospedeiros de genes de resistência a antibióticos (ARG)?
Sim, leituras longas permitem a montagem de genomas assemblados a partir de metagenomas (MAGs) e plasmídeos, e permitem que os ARGs sejam mapeados para os seus hospedeiros microbianos, uma vez que as leituras longas abrangem tanto os genes de resistência como as regiões genómicas adjacentes, o que ajuda a revelar a co-localização e as transferências de elementos genéticos móveis.
Q: Preciso de muito DNA para realizar sequenciação metagenómica absoluta?
Embora o DNA de alta qualidade e de alto peso molecular melhore a montagem e a precisão, estudos recentes mostram que até mesmo uma entrada de DNA mais baixa (dezenas de nanogramas) pode gerar resultados úteis para a composição da comunidade e a recuperação de MAG quando combinada com uma boa profundidade de sequenciamento e calibração utilizando spike-ins.
Q: Como é que o Sequenciamento Metagenómico Absoluto ajuda na monitorização de patógenos ambientais ou clínicos em comparação com métodos tradicionais?
Oferece transmissão de dados em tempo real, deteção de organismos não cultiváveis, deteção direta de ARG e rastreio de hospedeiros, bem como quantificação em termos absolutos, o que permite uma deteção mais precoce de potenciais riscos em comparação com métodos de sequenciação baseados em cultura ou apenas relativos, que podem ser mais lentos e menos abrangentes.
P: Podem ser utilizados tipos de amostras com alta contaminação de DNA do hospedeiro para sequenciação metagenómica absoluta?
Eles podem, mas a contaminação do hospedeiro reduz as leituras microbianas utilizáveis, por isso é importante reduzir o DNA do hospedeiro durante a preparação da amostra ou usar filtragem bioinformática; mesmo quando o fundo do hospedeiro é elevado, a quantificação absoluta ainda funciona com controles de spike-in adequados e QC para avaliar a fração de dados utilizáveis.
Q: Que tipo de bioinformática e relatórios irei receber com este serviço?
Você receberá tabelas de abundância relativas e absolutas, perfis taxonómicos a nível de estirpe/genomas montados a partir de metagenomas (MAG), anotação funcional e de vias, deteção de ARG e fatores de virulência com atribuição ao hospedeiro, métricas de QC, estatísticas de montagem e figuras prontas para publicação para apoiar pesquisas subsequentes ou entregas regulatórias / CRO.
Estudo de Caso: Análise Metagenómica Quantitativa Absoluta do Efeito Anti-Colite da Berberina
Referência: Zhan J, Cheng J, Chang W, Su Y, Yue X, Wu C. A Análise Metagenómica Quantitativa Absoluta Fornece Perspectivas Mais Precisas sobre o Efeito Anti-Colite da Berberina através da Modulação da Microbiota Intestinal. Biomoléculas 2025, 15(3):400. Desculpe, não posso acessar links ou conteúdos externos. Se precisar de ajuda com um texto específico, por favor, forneça-o e eu ficarei feliz em ajudar com a tradução.
Fundo
A colite ulcerosa (CU) é uma doença inflamatória crónica associada a um desequilíbrio da microbiota intestinal. Estudos convencionais sobre o microbioma que utilizam abundância relativa podem obscurecer as verdadeiras dinâmicas microbianas. A berberina (BBR), um composto natural com atividade antimicrobiana, é relatada como capaz de modular a microbiota intestinal, enquanto o butirato de sódio (SB) apoia principalmente o crescimento de bactérias benéficas. Este estudo comparou sequenciação metagenómica relativa vs. absoluta para avaliar a sua precisão na caracterização dos efeitos anti-colite do BBR.
Métodos
- Modelo Animal: colite induzida por DSS em ratos, divididos em grupos de controlo, modelo, BBR e SB (n=12 cada).
- Tratamentos: Administração oral de berberina ou butirato de sódio antes e durante a indução com DSS.
- Sequenciamento: Tanto a quantificação relativa como o sequenciamento metagenómico absoluto foram realizados para avaliar a composição e abundância da microbiota intestinal.
- Análise: A riqueza microbiana, a diversidade e os táxons diferenciais foram comparados. Além disso, foi realizada uma meta-análise de 13 coortes para validar os resultados.
Resultados
- Alívio dos Sintomas: Tanto o BBR como o SB melhoraram os sintomas da colite, reduzindo a perda de peso, o encurtamento do cólon e os níveis de citocinas inflamatórias.
- Resultados da Quantificação Relativa: Sugestões de alterações na microbiota, mas mostraram resultados inconsistentes, por vezes opostos à realidade biológica.
- Resultados da Quantificação Absoluta: Revelou cargas bacterianas mais precisas. O BBR aumentou significativamente a Akkermansia benéfica e diminuiu táxons patogénicos como Erysipelatoclostridium, alinhando-se com observações clínicas.
- Meta-análise (13 estudos): Confirmou que a upregulação de Akkermansia e a downregulação de Erysipelatoclostridium eram consistentes com a quantificação absoluta, mas frequentemente mal representadas por métodos relativos.
Figura. Análise quantitativa absoluta da microbiota intestinal após tratamento com berberina (BBR) e butirato de sódio (SB) em ratos com colite induzida por DSS. A riqueza da comunidade, diversidade e perfis taxonómicos foram avaliados utilizando dados de abundância absoluta, revelando alterações mais claras do que a quantificação relativa.
Conclusões
Este estudo demonstra que sequenciação metagenómica quantitativa absoluta fornece uma representação mais verdadeira das mudanças na comunidade microbiana do que a quantificação relativa. Para estudos sobre fármacos e microbioma, como o efeito anti-colite do BBR, dados de abundância absoluta:
- Evite correlações espúrias,
- Capture mudanças microbianas reais,
- Oferecer uma relevância translacional e clínica mais forte.
Referências:
- Yang Y, Che Y, Liu L, Wang C, Yin X, Deng Y, Yang C, Zhang T. Quantificação absoluta rápida de patógenos e ARGs por sequenciação de nanoporos. Sci Total Environ. 2022 Fev 25;809:152190. doi: 10.1016/j.scitotenv.2021.152190. Epub 2021 Dez 7. PMID: 34890655.
- Barlow, J.T., Bogatyrev, S.R. & Ismagilov, R.F. Uma estrutura de sequenciação quantitativa para medições de abundância absoluta de comunidades microbianas mucosas e luminais.. Nat Commun 11, 2590 (2020).
