Sequenciação de Bisulfito de Genoma Inteiro (WGBS)

Como um fornecedor líder de serviços de NGS, a CD Genomics está a fornecer um portefólio integrado de serviços de sequenciação de metilaçãoA sequenciação de bisulfito do genoma completo (WGBS) é uma estratégia eficaz e fiável para identificar citosinas metiladas individualmente em uma escala genómica. Com mais de 10 anos de experiência e a mais avançada tecnologia. sequenciação de nova geração plataformas, podemos totalmente atender aos requisitos e orçamentos do seu projeto na exploração do metiloma.

O que é o sequenciamento de bisulfito de genoma completo?

Na biologia dos mamíferos, a 5-metilcitosina envolve uma ligação covalente entre um grupo metilo e a posição do carbono 5' da citosina, conferindo assim características capacitivas adicionais para a transdução de sinais e funcionalidade regulatória. Como uma das modificações epigenéticas predominantes, a 5-metilcitosina desempenha um papel fundamental em numerosos processos biológicos, incluindo o silenciamento de genes, a repressão de transposões, a inibição de sequências repetitivas, a impressão genética e a inativação do cromossoma X. A deteção e quantificação da metilação são fundamentalmente críticas para compreender a expressão gênica e outros processos sujeitos à regulação epigenética.

A metilação do DNA constitui uma parte vital de epigenética, desempenhando um papel integral na manutenção das funções celulares normais, impressão genética, desenvolvimento embrionário e no início da tumorigenese humana. O WGBS, que emprega uma conversão de bisulfito de citosinas não modificadas em uracilos no DNA genómico, permite a geração de um perfil de metilação abrangente. Ao realizar um resequenciamento de alto rendimento do DNA convertido e compará-lo com um genoma de referência, o método WGBS possibilita uma análise em todo o genoma das métricas de metilação com resolução de base única, oferecendo alta precisão. A sua aplicação mais ampla abrange desde a investigação dos mecanismos fundamentais da diferenciação celular e desenvolvimento de tecidos até ao avanço de áreas como a reprodução agrícola, saúde humana e tratamento de doenças.

WGBS é o método preferido para traçar mapas abrangentes de metilação de DNA ao nível de bases individuais. Esta abordagem, frequentemente referida como o "padrão ouro" para sequenciação de metilação, destaca-se devido à sua alta capacidade de processamento, eficiência temporal, resolução de base única e ampla cobertura.

Princípio do WGBS

O princípio do WGBS baseia-se no tratamento com bisulfito pesado para converter citosinas não metiladas no genoma em uracilos, que se tornam timinas após a amplificação por PCR e podem, assim, ser distinguidas das citosinas metiladas. Juntamente com a tecnologia de sequenciação de alto rendimento e a comparação de sequências de referência, a metilação em locais CpG/CHG/CHH pode ser determinada, tornando-a particularmente adequada para a construção de mapas de metilação de DNA em todo o genoma com resolução de base única. Para mais informações detalhadas, consulte o artigo, "Princípios e Fluxo de Trabalho da Sequenciação de Bisulfito de Genoma Inteiro.

Vantagens do WGBS

• Adequado para investigação em humanos e na maioria dos animais e plantas (com genomas de referência conhecidos).
• Padrões de metilação de DNA de resolução única altamente integrados.
• Obter de forma maximizada informações abrangentes sobre a metilação do genoma completo, mapeando com precisão os padrões de metilação.
• Fornecendo informações sobre o compromisso do destino celular dos genes e reprogramação, bem como a regulação genética.
• Identificação de novas marcas epigenéticas e alvos de doenças.

Aplicação de WGBS

• Regulação da expressão génica
• Heterogeneidade epigenética
• Ambiente e epigenética
• Desenvolvimento embrionário
• Pesquisa de doenças
• Impressões genéticas
• Pesquisa de tumores
• Pesquisa sobre a estabilidade do genoma
• Pesquisa em biologia evolutiva

Diferentes Técnicas de Detecção de Metilação de DNA

450 mil/850 mil

Esta tecnologia escaneia e detecta aproximadamente 450K e 850K sítios CpG importantes conhecidos no genoma através de escaneamento por chip. Apresenta alta precisão e repetibilidade, mas está limitada a amostras humanas e não consegue detectar novos sítios CpG fora do chip no genoma.

MeDIP-seq

Sequenciação por imunoprecipitação de DNA metilado (MeDIP-seq) enriquece e sequencia regiões que estão a sofrer metilação, obtendo o estado de metilação da maioria das regiões mais metiladas em todo o genoma. Carece de resolução a nível de base única e quantificação absoluta dos níveis de metilação, fornecendo apenas níveis de metilação relativos. É adequado para explorar o estado de metilação em todo o genoma sem a necessidade de resolução a nível de base única.

WGBS

Esta técnica pode detectar locais CpG eficazes, alcançando mais de 75% de todos os locais CpG em todo o genoma, conseguindo uma resolução de base única. É adequada para estudar de forma sistemática e abrangente o estado de metilação em todo o genoma.

RRBS

Sequenciação de bisulfito com representação reduzida (RRBS) deteta o estado de metilação de regiões ricas em locais do tipo CG (principalmente regiões regulatórias) no genoma, com resolução de base única e alta relação custo-eficácia. É adequado para estudar o estado de metilação de regiões regulatórias.

Target-BS

Sequenciação por bisulfito direcionada projeta primers para fragmentos-alvo, realiza amplificação por PCR após conversão de BS e, finalmente, constrói bibliotecas para sequenciação de próxima geração. A profundidade de sequenciação das regiões-alvo pode atingir desde centenas até dezenas de milhares, permitindo a deteção precisa dos níveis de metilação em locais C dentro das regiões-alvo. É utilizado para a verificação subsequente da metilação de genes-alvo.

Microarray de Metilação de DNA

O Serviço de Análise de Metilação de DNA Illumina 935K é uma ferramenta sofisticada projetada para a exploração da metilação do DNA. O Infinium MethylationEPIC v2.0 BeadChip (935K) facilita a análise em alta capacidade de aproximadamente 935.000 locais CpG dispersos por todo o genoma humano. Esta versão atualizada oferece uma cobertura e precisão melhoradas, garantindo conformidade com os bancos de dados genómicos mais recentes. Atributos notáveis deste dispositivo incluem capacidades de investigação de todo o genoma, fiabilidade confirmada e ampla compatibilidade com diversas categorias de espécimes, incluindo tecidos fixados em formalina e embebidos em parafina. O serviço destina-se especificamente a estudos epigenéticos abrangentes, fornecendo aos investigadores os meios para decifrar os mecanismos subjacentes das doenças e identificar potenciais biomarcadores.
A Illumina Array de Triagem de Metilação 270K (MSA270K) representa uma inovação de ponta adaptada para exames meticulosos de metilação especificamente realizados dentro de coortes de doenças distintas e avaliações de saúde abrangentes. Abrangendo aproximadamente 270.000 loci de metilação, esta ferramenta oferece uma eficiência melhorada ao permitir um rendimento de 48 amostras por array, constituindo um aumento de seis vezes em comparação com o seu antecessor. Capacitando os cientistas a avançar em esforços exploratórios relacionados a padrões fenotípicos de doenças, influências ambientais na epigenética e alterações na metilação ligadas ao envelhecimento, o MSA270K fortalece significativamente a nossa compreensão da metilação do DNA e seus efeitos consequentes na saúde humana e nas condições de doença. Isso catalisa mudanças de paradigma na compreensão fundamental do nosso código genético inato, desbloqueando potenciais futuras avenidas terapêuticas.

Fluxo de Trabalho WGBS

A nossa equipa de especialistas altamente experientes e o rigoroso controlo de qualidade que segue cada procedimento garantem resultados abrangentes e precisos. Antes da sequenciação de alto rendimento, a amostra de DNA é processada com conversão de bisulfito de citosina, seguida de marcação nas extremidades 5' e 3', e a introdução de adaptadores Illumina através da amplificação por PCR.

Para garantir a precisão e fiabilidade dos dados de sequenciação, a CD Genomics executa meticulosamente cada etapa experimental, desde a amostragem de DNA até a aquisição do relatório final de dados, através de rigorosas avaliações de controlo de qualidade. Esta abordagem abrangente garante fundamentalmente uma saída de dados de alta qualidade. A obtenção de dados de alta qualidade é o pré-requisito fundamental para resultados precisos, abrangentes e credíveis. bioinformática análise.

Especificação do Serviço

	Requisitos e preparação de amostras Fontes de amostras incluindo humanos, animais, plantas e microrganismos. DNA genómico (DNA ≥ 1 µg; concentração ≥ 10 ng/µl; OD260/280=1.8-2.0) Célula≥1x106 Amostras de tecido ≥50 mg Protocolo de preparação de amostras, provavelmente incluindo extração de DNA genómico, purificação, quantificação, controlo de qualidade, etc.
	Sequenciação Plataformas HiSeq, paired-end de 150 bp Mais de 80% das bases com uma pontuação de qualidade ≥Q30 Profundidade de sequenciação > 20X
	Análise de Dados Fornecemos múltiplas análises de bioinformática personalizadas: Alinhamento contra o genoma de referência Análise de profundidade e cobertura de sequências mC a chamar Análise do nível de metilação Tendências globais do metiloma Análise da densidade de metilação Análise de Regiões Methyladas Diferencialmente (DMRs) Anotação DMR e análise de enriquecimento (GO/KEGG) Análise de clustering

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes em WGBS para a sua escrita (personalização)

Beneficiando das plataformas de sequenciação de próxima geração de última geração e de uma vasta experiência, garantimos dados de alta qualidade e análises bioinformáticas integradas. Se estiver interessado no que a CD Genomics pode fazer com a sequenciação de bisulfito do genoma completo, não hesite em contactar-nos. Estamos ansiosos por avançar com o seu projeto.

Referências:

1. Huang, K., & Fan, G. Metilação de DNA na diferenciação celular e reprogramação: uma nova visão sistemática. Medicina regenerativa, 2010, 5(4), 531-544.
2. Beck D, Ben Maamar M, Skinner M K. Comparações de métodos de análise de densidade de CpG e metilação de DNA em todo o genoma (MeDIP, RRBS e WGBS). Epigenética, 2022, 17(5): 518-530.
3. Abante J, Fang Y, Feinberg A P, et al. Detecção de metilação de DNA específica de alelos dependente de haplótipo em dados de WGBS. Comunicações da Natureza, 2020, 11(1): 5238.
4. Suzuki M, Liao W, Wos F, et al. Sequenciação de bisulfito de todo o genoma com precisão e custo melhorados. Pesquisa do genoma, 2018, 28(9): 1364-1371.

Resultados da Demonstração

Perguntas Frequentes sobre Sequenciação de Bisulfito de Genoma Inteiro

1. Quais espécies são adequadas para sequenciação de bisulfito do genoma completo?

As espécies sujeitas a sequenciação de bisulfito de genoma devem cumprir as seguintes três condições:

a. Eucariotos.
b. O seu genoma de referência foi montado pelo menos ao nível do andaime.
c. Anotações genómicas relativamente completas.

2. Quais são os principais conteúdos da análise avançada de bioinformática em WGBS?

A análise da correlação entre os níveis de metilação e os níveis de transcrição constitui um componente principal da análise bioinformática avançada em sequenciação de metilação de genoma completo. Abrange principalmente quatro aspetos:

1. Níveis de metilação de genes diferencialmente expressos.
2. Níveis de metilação de elementos transponíveis diferencialmente expressos.
3. Relação entre modificações de metilação e regulação da expressão.
4. Análise da expressão de genes metilados e não metilados.

3. Quais são as vantagens do WGBS em comparação com outros métodos de sequenciação de metilação?

No campo da sequenciação de metilação de DNA, as metodologias principais atuais incluem a Sequenciação de Bisulfito de Genoma Inteiro (WGBS), Imunoprecipitação de DNA Metilado (MeDIP)e Sequenciação de Bisulfito com Representação Reduzida (RRBS)O WGBS apresenta a vantagem de permitir a avaliação do estado de metilação em quase todos os locais CpG. Esta avaliação pode estender-se a áreas de baixa densidade de CpG, incluindo "desertos genéticos" intergénicos, domínios parcialmente metilados e elementos regulatórios distantes. Além disso, o WGBS pode revelar níveis absolutos de metilação de DNA e o contexto da sequência de metilação. No entanto, deve-se notar que o MeDIP não consegue alcançar uma resolução de metilação a nível de base única, e o RRBS normalmente seleciona áreas com um maior grau de metilação para análise, o que impede a obtenção do estado de metilação a nível de gene completo.

4. Quais são as limitações do WGBS?

1. Este método só consegue detetar 5mC ou 4mC e não é capaz de detetar 6mA.
2. O tratamento com bisulfito leva a uma fragmentação significativa do ADN, o que pode afetar a amplificação.
3. A conversão de citosinas não metiladas em uracilos durante o tratamento com bisulfito aumenta a complexidade da preparação da biblioteca. A conversão incompleta também pode introduzir viés nos resultados.
4. O método não consegue distinguir efetivamente entre 5mC e 5hmC.

Referências:

1. Beck D, Ben Maamar M, Skinner M K. Comparações de métodos de análise de densidade de CpG e metilação de DNA em todo o genoma (MeDIP, RRBS e WGBS). Epigenética, 2022, 17(5): 518-530.
2. Suzuki M, Liao W, Wos F, et al. Sequenciação de bisulfito de todo o genoma com precisão e custo melhorados. Pesquisa genómica, 2018, 28(9): 1364-1371.

Estudos de Caso de Sequenciação de Bisulfito do Genoma Completo

Padrões de metilação de DNA divergentes associados à expressão génica em cultivares de arroz com resposta contrastante ao stress hídrico e salino.

Revista: Scientific Reports
Fator de impacto: 4,259
Publicado: 09 de Outubro de 2015

Fundo

A metilação do DNA desempenha um papel central na regulação da atividade genética e da estrutura da cromatina em resposta a condições ambientais. A compreensão da metilação do DNA em todo o genoma fornece informações sobre os mecanismos regulatórios da resposta/adaptação ao stress abiótico.

Materiais: Três cultivares de arroz (Oryza sativa), IR64 (sensível à seca e salinidade), Pokkali (tolerante à salinidade) e Nagina 22 (tolerante à seca).

Métodos

Resultados

Os investigadores analisaram as diferenças entre as três variedades nos padrões de metilação do DNA, nas RDMs (Regiões Diferencialmente Metiladas) e na expressão génica, e investigaram ainda as correlações subjacentes.

A metilação diferencial está acoplada à expressão diferencial de genes em diferentes cultivares.

Em comparação com todos os genes, aqueles próximos a regiões diferencialmente metiladas (DMRs) altamente metiladas demonstram um nível mais baixo de abundância de transcritos, indicativo de regulação negativa. Em contraste, os genes próximos a DMRs pouco metiladas exibem níveis semelhantes ou ligeiramente mais altos de abundância de transcritos, sugerindo uma regulação positiva. Para as DMRs, a metilação do DNA também parece correlacionar-se com o estado de ativação/desativação da expressão gênica, evidenciado por 14,5% em N22/IR64 e 7,2% em PK/IR64.

Figura 1. Relação entre a metilação diferencial e a abundância de transcritos de genes codificadores de proteínas.

2. Metilação diferencial de genes associados à resposta ao stress e regulação epigenética da expressão génica.

O nível de metilação diferencial e a correspondente expressão gênica diferencial dos genes de arroz em N22/IR64 e PK/IR64 estão mostrados na Fig. (a) abaixo. A análise de GO dos genes associados a DMR em ambos N22/IR64 e PK/IR64 revelou um enriquecimento significativo de genes que participam na resposta ao estresse.

Figura 2. Metilação diferencial, abundância de transcritos e enriquecimento de GO de genes codificadores de proteínas.

O estado de metilação dos elementos transponíveis está correlacionado com a transcrição de genes codificadores de proteínas proximais.

O enriquecimento de TEs foi substancialmente mais elevado para os DEGs associados a DMR em comparação com os non-DEGs tanto para N22/IR64 (valor-P 1.49e-05) como para PK/IR64 (valor-P 5.26e-05) (a). Diferenças significativamente maiores no nível de metilação dos DMRs estão associadas a TEs em comparação com genes codificadores de proteínas para PK/IR64 (b).

Figura 3. Correlação entre a expressão diferencial e a frequência/nível de metilação de TEs.

Conclusão

Os resultados sugerem o papel potencial de padrões de metilação de DNA específicos de cultivares como um mecanismo regulador crucial para a deteção e resposta às condições de stress, através da modulação da expressão de genes responsivos ao stress. As investigações sugerem que a variabilidade para tolerância à seca ou salinidade no germoplasma de arroz depende da extensão e dos padrões de metilação de DNA. E as evidências sugerem que a metilação de DNA desempenha um papel importante na resposta ao stress abiótico, regulando a expressão de um conjunto de genes responsivos ao stress no arroz, principalmente através da metilação ou desmetilação de elementos transponíveis proximais.

Referência:

1. Garg R, Chevala V V S N, Shankar R, et al. Padrões divergentes de metilação de DNA associados à expressão génica em cultivares de arroz com respostas contrastantes ao stress hídrico e salino. Relatórios científicos, 2015, 5.