Diretrizes para Submissão de Amostras
Introdução
A sequenciação Hi-C tradicional tem sido a pedra angular para o estudo da arquitetura do genoma em 3D, mas a sua limitação a interacções par a par deixa muitas estruturas de cromatina de ordem superior não resolvidas. À medida que os projectos genómicos avançam para montagens telómero a telómero (T2T), organismos poliploides e genomas de plantas e animais complexos, os investigadores enfrentam um desafio crescente: Como podemos ancorar com precisão os contigs, resolver os centrómeros e capturar a verdadeira complexidade da cromatina?
A sequenciação Pore-C, um método de captura da conformação da cromatina baseado em Nanopore de leituras longas, fornece a solução. Ao sequenciar diretamente concatemers ultra-longos, a tecnologia nanopore Pore-C revela simultaneamente interações cromatínicas em múltiplas direções e Metilação do DNA, oferecendo insights além do alcance do Hi-C. Para investigadores em laboratórios de bioquímica, colaborações com CRO e instituições académicas, o Pore-C abre uma nova dimensão na montagem do genoma e na descoberta epigenética.
Visão Geral da Tecnologia: O que é Sequenciação Pore-C?
Sequenciação Pore-C é avançado Tecnologia de captura de conformação da cromatina baseada em nanoporos que supera as limitações do Hi-C. Ao combinar o entrelaçamento e a ligação da cromatina com Sequenciação de longas leituras da Oxford Nanopore, Pore-C permite a deteção direta de interacções de cromatina multi-direcionais ao longo de moléculas de DNA únicas.
Como Funciona
- Entrelaçamento e Digestão: As interações da cromatina são preservadas através da fixação com formaldeído e do corte com enzimas de restrição.
- Ligação: Fragmentos de DNA em proximidade espacial próxima são ligados em concatemers, retendo a sua informação de contacto em 3D.
- Sequenciação por Nanoporos: Concatenados ultra-longos são sequenciados diretamente, capturando múltiplos loci interagentes dentro de uma única leitura.
- Dados Integrados: Além das interações de cromatina em 3D, a sequenciação Pore-C preserva os sinais de metilação de DNA nativos, fornecendo tanto insights estruturais como epigenéticos num único fluxo de trabalho.
Por Que É Importante
- Ao contrário do Hi-C, que está restrito a interações par a par, a sequenciação por nanoporo Pore-C fornece mapas de contacto de ordem superior que refletem a verdadeira complexidade do dobramento da cromatina.
- Dados de interação multi-direcional melhoram a precisão da montagem do genoma telómero-a-telómero, a resolução do centrómero e a estruturação de poliploides.
- A deteção de metilação incorporada acrescenta uma nova dimensão à investigação epigenética.
Pore-C vs Hi-C: Uma Nova Dimensão na Análise do Genoma
| Recurso | Hi-C | Pore-C |
|---|---|---|
| Tipo de Interação | Apenas par a par (dois loci de cada vez) | Interacções múltiplas (3+ loci numa única leitura) |
| Comprimento de Leitura | Illumina de leitura curta | Concatenados de Nanopore ultra-longos |
| Informação Epigenética | Não capturado | Deteção direta de metilação do DNA |
| Profundidade de Ancoragem do Genoma | Requer cerca de 100× de cobertura. | Resultados comparáveis com ~30× cobertura |
| Regiões Complexas | Resolução limitada do centrómero | Sinais fortes em centrómeros e repetições |
| Montagem Poliplóide | Maior risco de erros de junção entre homólogos | Redução de falsos emparelhamentos, maior precisão na estruturação. |
| Saída de Dados | Mapas de calor de contacto | Mapas de calor de contacto + redes multi-direcionais + trilhos de metilação |
Por que o Pore-C supera o Hi-C
- Sinais de interação mais fortes em todo o genoma, incluindo os centrómeros.
- Assemblagens de genoma mais completas em espécies diploides e poliploides.
- Perspectivas duplas: estrutura da cromatina em 3D e modificações epigenéticas.
- Profundidade de sequenciação eficiente: 30× Pore-C pode igualar o poder de ancoragem de 100× Hi-C.
Fluxo de Trabalho de Serviço
Aplicações da Sequenciação Pore-C
Sequenciação Pore-C oferece uma solução poderosa para equipas de investigação que procuram ir além das limitações do Hi-C. Com a capacidade de capturar interacções cromatínicas multi-direcionais e detetar Metilação do DNA simultaneamente, análise de nanoporos pore-c apoia uma ampla gama de aplicações nas ciências da vida e na agricultura.
Montagem e Estruturação do Genoma
- Fortalece a ancoragem de contigs em projetos de genoma de telómero a telómero (T2T).
- Melhora a resolução dos centrómeros, regiões repetitivas e variantes estruturais.
- Fornece uma precisão superior de andaimes para genomas complexos ou grandes.
Pesquisa do Genoma Poliploide
- Reduz as desassemblagens ao minimizar os sinais de cruzamento entre cromossomas homólogos.
- Proporciona uma separação mais clara dos subgenomas em plantas e animais poliplóides.
- Suporta a faseação precisa de haplótipos e estudos evolutivos.
Arquitetura Genómica 3D
- Permite o mapeamento de estruturas de cromatina de ordem superior além de contactos par a par.
- Revela redes de interação múltipla que governam a regulação genética.
- Avanços na compreensão fundamental da organização nuclear.
Epigenética e Biologia da Cromatina
- Detecta padrões de metilação do DNA juntamente com interações estruturais.
- Oferece uma visão integrada da regulação epigenética em espaço 3D.
- Facilita a investigação sobre o controlo da expressão génica, impressão e silenciamento.
Reprodução de Plantas e Animais
- Acelera a construção do pan-genoma e estudos de diversidade.
- Suporta a identificação de características estruturais ligadas a traços agronómicos e de resistência a doenças.
- Fornece insights de alto valor para programas de melhoria genética.
Estratégias Pore-C Recomendadas para Diferentes Níveis Genómicos
Para maximizar os benefícios de Sequenciação Pore-C na montagem de genomas, diferentes estratégias são recomendadas dependendo do nível do genoma alvo. Estas combinações garantem um equilíbrio ótimo entre a precisão das leituras, interações de longo alcance e profundidade de sequenciação.
| Nível Genómico | Estratégia Recomendada |
|---|---|
| Genoma a nível de cromossoma | 30× HiFi + 30× Pore-C + 50× NGS |
| Genoma T2T | 30× HiFi + 30× ONT ultra-longo + 30× Pore-C + 50× NGS |
| Genoma T2T Perfeito | 40–60× HiFi + 60–100× ONT ultra-longo + 30× Pore-C + 50× NGS |
| Genoma T2T Haploide Perfeito | 80–120× HiFi + 120–200× ONT ultra-longo + 60× Pore-C + 50× NGS |
Análise de Dados e Bioinformática
O verdadeiro valor de Sequenciação Pore-C não reside apenas na geração de dados de concatâmeros de leitura longa, mas também na extração de sinais de interação precisos e eficientes. Na CD Genomics, utilizamos métodos otimizados pipelines de análise de porosidade para garantir resultados de alta qualidade para a montagem do genoma e investigação do genoma em 3D.
Estratégia de Análise Otimizada
Os pipelines tradicionais de Hi-C dependem de um corta-primeiro, alinha-depois método, que muitas vezes subestima o poder único do Pore-C. Em vez disso, usamos um alinhar primeiro, cortar depois abordagem adaptada para dados de Nanopore:
- A alinhamento de leitura completa ao genoma de referência preserva o contexto de longo alcance.
- A análise de fragmentos pós-alinhamento evita a sobre-divisão e reduz erros de múltiplas mapeações.
- A extração precisa de pares válidos aumenta as taxas de dados utilizáveis e a resolução de interação.
Esta estratégia melhora significativamente o taxa de dados válida comparado com métodos convencionais, garantindo que cada leitura Pore-C contribua de forma mais eficaz para a análise subsequente.
Novas Métricas de QC para Pore-C
Para além da geração de mapas de contacto padrão, o nosso fluxo de trabalho de bioinformática avalia conjuntos de dados Pore-C com métricas especializadas, incluindo:
- Contagem Média de Fragmentos – número médio de loci capturados por leitura.
- Relação Contactos/Leituras – eficiência da captura de interações por leitura.
- Tamanho Válido/Tamanho Total – proporção de dados efetivamente utilizados.
- Comprimento Médio de Pares Válidos – distância abrangida por interações válidas.
Estas métricas fornecem insights mais profundos sobre ambos. qualidade dos dados e força do sinal biológico, garantindo uma interpretação fiável.
Entregáveis
Os clientes recebem um pacote de dados completo que pode ser diretamente integrado em estudos genómicos e epigenéticos:
- Dados de sequenciação Raw Nanopore (FASTQ/FAST5)
- Pares de interação processados (contactos múltiplos)
- Mapas de contacto de cromatina e redes de interação 3D
- Perfis de metilação de DNA juntamente com dados estruturais
- Relatório de bioinformática abrangente com estatísticas de QC e visualizações
Garantia de Qualidade de Dados Pore-C
A sequenciação Pore-C oferece geração de dados de alta qualidade com foco em tipos de amostras ótimas para resultados fiáveis.
| O índice de sequencia | rendimento (/célula) | |
|---|---|---|
| Espécies convencionais | passa lê N50≥1Kb | Dados brutos ≥50Gb |
| Descrição de amostra | 1. Recomenda-se enviar amostras de plantas com folhas jovens recém-crescidas. 2. Recomenda-se que as amostras de animais deem preferência a sangue fresco, seguido de fígado e outros tecidos. 3. Amostras não convencionais não garantem rendimento de sequenciação. 4. As amostras não convencionais de sequenciação por nanoporo são as seguintes: 1) plantas com muitos metabolitos secundários; 2) oceanos e produtos aquáticos (animais e plantas, algas, etc.); 3) coelhos, insetos, anfíbios, aves, etc. |
|
Requisitos de Amostra para Sequenciação Pore-C
Para garantir resultados de alta qualidade, por favor siga as diretrizes abaixo ao preparar e enviar as suas amostras. Todas as amostras devem ser congelado instantaneamente em azoto líquido, armazenado em −80 °C, e enviado em gelo seco para evitar a degradação.
| Tipo de Amostra | Quantidade Recomendada |
|---|---|
| Célula | ≥ 106 células |
| Mononucleóides do sangue periférico (PBMCs) | Pelote de PBMC de ~5 ml de sangue total fresco |
| Tecido animal | ~50-100 mg de tecido criomolido |
| Material de inseto | ~50-100 mg de material moído a frio |
| material de C. elegans | ~1 ml de pó de verme criogénico moído |
| Material vegetal | ~2 g de material vegetal |
Notas Importantes:
- Identifique claramente cada tubo com o ID da amostra (letras + números) e assegure-se de que corresponde ao Formulário de Informação da Amostra.
- Evite ciclos de congelamento-descongelamento.
- Não exceda 5× as quantidades de entrada recomendadas, a menos que especificado de outra forma para amostras de baixo rendimento.
Por que escolher a CD Genomics para sequenciação do genoma completo?
Desde plataformas de sequenciação avançadas até à entrega de dados de alta qualidade, a CD Genomics oferece uma solução eficiente, de ponta a ponta, adaptada a diversas necessidades de investigação. A nossa equipa garante resultados fiáveis com um suporte flexível.
- Especialização ComprovadaA nossa equipa tem uma vasta experiência em técnicas de conformação da cromatina, incluindo trabalho pioneiro com Pore-C desde 2022.
- Protocolos Otimizados e RobustosRefinámos cada etapa (entrecruzamento, lise, ligação, limpeza) para obter o máximo rendimento e complexidade, minimizando os preconceitos.
- Sequenciação de Alto DébitoO acesso direto às plataformas PromethION 48 garante uma cobertura de sequenciação profunda de forma rápida.
- Bioinformática AvançadaAlém de pipelines standard, oferecemos uma análise de contacto multi-direcional sofisticada, integração e soluções personalizadas.
- Controlo de Qualidade RigorosoMúltiplos pontos de controlo de QC garantem a fiabilidade dos dados.
- Suporte de Ponta a PontaDesde a consulta de design do projeto até o apoio à interpretação final.
Perguntas Frequentes (FAQ)
Pore-C é uma técnica de sequenciação que permite mapear a estrutura tridimensional do genoma, utilizando poros de nanopartículas para capturar interações entre regiões do DNA. A principal diferença em relação ao Hi-C é que o Pore-C utiliza uma abordagem baseada em poros, o que proporciona uma resolução mais alta e uma melhor representação das interações genómicas em comparação com o Hi-C, que utiliza métodos de ligadura e sequenciação convencionais.
Pore-C é um método de captura da conformação da cromatina que utiliza sequenciação de Nanopore de leitura longa em vez de leituras curtas; captura interações cromatínicas multi-direcionais (3 ou mais loci) em leituras únicas, preserva a metilação do DNA, simplifica a preparação da biblioteca ao eliminar a rotulagem com biotina e etapas de PCR, e resolve regiões complexas que são desafiadoras para o Hi-C.
P: O Pore-C consegue detetar modificações epigenéticas e interacções ao mesmo tempo?
Sim, porque o Pore-C utiliza sequenciação por Nanopore, que é livre de PCR e retém as modificações de base de DNA nativas; assim, tanto as redes de interação da cromatina como as assinaturas de metilação (por exemplo, 5mC) podem ser obtidas a partir do mesmo conjunto de dados.
Q: Que tipos de amostras são adequadas para sequenciação Pore-C?
Amostras que incluem células entrelaçadas, tecidos de plantas ou animais, material biológico fresco ou congelado que possa preservar a estrutura da cromatina são adequadas; o Pore-C tem sido utilizado com sucesso para linhas celulares humanas, tecidos foliares de plantas e tipos de tecidos animais, frequentemente necessitando de fixação e purificação adequadas para reter os sinais de interação.
Q: Quais são as saídas de dados típicas e os formatos de ficheiro da análise Pore-C?
O fluxo de trabalho Pore-C produz leituras brutas de long-read FASTQ ou BAM/concatemer, pares de contactos processados, matrizes de interacção multi-direccional (cooler/.mcool ou estilo HiC), anotação de metilação e métricas de QC, como contactos válidos por leitura, contagem de fragmentos, e razões de contactos inter- versus intra-cromossómicos.
Q: Quanta profundidade de sequenciação é necessária para o Pore-C alcançar uma montagem de genoma útil ou mapeamento de interações?
A profundidade necessária depende do tamanho e complexidade do genoma: para a montagem a nível de cromossoma, uma cobertura moderada combinada com Pore-C geralmente é suficiente; para montagens de telómero a telómero ou genomas poliploides, uma maior cobertura de leituras longas e Pore-C melhora os resultados; o Pore-C geralmente alcança montagens comparáveis a uma profundidade muito maior de Hi-C com menos bases quando processado corretamente.
Q: Quais fluxos de trabalho de bioinformática são utilizados para a análise de dados Pore-C?
Os pipelines típicos utilizam uma abordagem de "alinhar primeiro, depois fragmentar", mapeando leituras longas completas ao genoma de referência, depois analisando fragmentos de ligadura com base nos locais de corte da enzima de restrição, extraindo informações de múltiplos contactos e contactos par a par, gerando mapas de contacto, perfis de metilação, controlo de qualidade e visualização; ferramentas como wf-pore-c são comumente utilizadas.
Estudo de Caso: Aplicação de HiPore-C para Revelar a Dobragem do Genoma 3D Específica de Alelos
1. Contexto
O Hi-C tradicional captura interacções cromatínicas em pares, mas não consegue resolver. contactos multiuso ou topologia de alelo único. Esta limitação dificulta a nossa compreensão das estruturas genómicas 3D de ordem superior e do seu variação específica do tipo celularPore-C, e a sua versão otimizada de alto rendimento (HiPore-C), permitem o sequenciamento direto de concatâmeros contendo múltiplos fragmentos de ADN ligados, permitindo assim a descoberta de interações multi-fragmento e informação epigenética dentro de leituras longas únicas.
2. Métodos
Os autores aplicaram HiPore-C a humanos. GM12878 (linfócito B) e K562 (eritroleucemia) células. Melhorias na preparação da biblioteca (digestão com proteinase K + pronase) superaram o entupimento dos poros de nanopore e aumentaram o rendimento de sequenciação. Em seguida, integraram Sequenciação por nanopore com o Pipeline MapPore-C, que mapeia leituras de múltiplos fragmentos ao genoma de referência e extrai ambos. interacções múltiplas e Padrões de metilação do DNA.
- Técnica-chave: HiPore-C com sequenciação ONT PromethION.
- Análise de Dados: Comparação com Hi-C, agrupamento de topologias de alelos únicos e perfilagem simultânea de metilação.
3. Resultados
- HiPore-C capturou com sucesso estruturas genómicas 3D canónicas, como compartimentos A/B, TADs e laços, com alta concordância com Hi-C (r = 0,958 para vetores próprios; r = 0,868 para pontuações de isolamento).
- Interacções de Ordem Superior: ~38% das leituras continham fragmentos intercrómicos, revelando centros de cromatina activa e inactiva (ver Figura 3 na página 5).
- Resolução de Alelos Únicos: Leituras agrupadas em topologias específicas de tipo celular, mesmo em TADs conservados (Figura 5 na página 10).
- Relevância Funcional: No locus da β-globina, o HiPore-C revelou que os centros de potenciadores se formam apenas nas células K562, onde os genes da globina embrionária e fetal são expressos. Em GM12878, o mesmo locus permaneceu silencioso (Figura 6 na página 12).
- Epigenética: HiPore-C capturou com precisão a metilação de CpG, consistente com WGBS (r = 0,80), e ligou-a às estruturas da cromatina (Figura 7 na página 14).
HiPore-C identifica um hub de potenciadores específico de tipo celular no locus da β-globina, revelando interações simultâneas entre potenciadores e genes de globina fetal em células K562, mas não em células GM12878.
4. Conclusões
HiPore-C oferece uma solução de ponta a ponta para explorar a dobra do genoma com resolução de alelo único, ao mesmo tempo que perfilando a metilação do DNA. Revelou diversos clusters de topologia dentro dos TADs, centros de promotores e potenciadores específicos de tipo celular, e regulação epigenética incorporada na arquitetura do genoma em 3D. Isto demonstra o seu potencial para genómica funcional, investigação de doenças e montagem de genomas poliploides.
Referências:
- Sean P. McGinty, Gulhan Kaya, View, Sheina B. Sim et al. CiFi: Captura de conformação da cromatina de longa leitura precisa com requisitos de entrada baixos.
- Zhang, Z., Yang, T., Liu, Y. et al. A montagem de genoma resolvida por haplótipos e a re-sequenciação fornecem informações sobre a origem e a reprodução da rosa moderna.. Planta Nat.s 10, 1659–1671 (2024).
- Tianyu Yang, Yifan Cai, Tianping Huang et al., Uma montagem de genoma de referência sem lacunas, do telómero ao telómero, do abacate fornece recursos úteis para identificar genes relacionados à biossíntese de ácidos gordos e resistência a doenças., Pesquisa em Horticultura, Volume 11, Edição 7, Julho de 2024, uhae119,
- Jeon, D., Sung, YJ. & Kim, C. Montagem Genómica de Nível Cromossómico de Alta Qualidade do Wasabi (Eutrema japonicum) 'Magic'. Dados Científicos 11, 1044 (2024).
- Jonghwan Choi, Taemin Kang, Sun-Jae Park, Seunggwan Shin, Uma Montagem de Genoma de Referência em Escala de Cromossoma e Anotada de Plecia longiforceps Duda, 1934 (Diptera: Bibionidae), Biologia do Genoma e Evolução, Volume 16, Edição 10, Outubro de 2024, evae205,
- Zhong, JY., Niu, L., Lin, ZB. et al. Pore-C de alto rendimento revela a topologia de alelo único e a especificidade de tipo celular da dobragem do genoma 3D.. Nat Commun 14, 1250 (2023).
