Sequenciação Epigenómica (Análise de Metilação de DNA/RNA)

A CD Genomics está a oferecer plataformas para análise epigenómica em todo o genoma, cada uma projetada para acomodar uma ampla gama de tipos de amostras e atender às suas necessidades específicas de pesquisa, permitindo que os investigadores analisem facilmente as alterações epigenéticas. Esta informação ajudará não apenas a entender o papel da metilação do DNA, mas também a identificar alvos para tratamento terapêutico.

O que são Modificações Epigenéticas

As modificações epigenéticas são modificações reversíveis que afetam a expressão génica sem alterar a sequência de DNA e podem ser herdadas durante a divisão celular. Duas das modificações epigenéticas mais caracterizadas são a metilação do DNA e a modificação da cromatina. As modificações epigenéticas desempenham papéis importantes na expressão e regulação génica, e estão envolvidas em numerosos processos celulares, como na diferenciação, desenvolvimento e tumorigenese. A metilação do DNA é mais frequentemente observada na posição C5 da citosina, seguida pela guanina (local CpG) em vertebrados, ou em locais não CpG, como CHG e CHH em plantas ou células-tronco embrionárias de mamíferos. A metilação do DNA é estabelecida e mantida por metiltransferases de DNA (DNMT1, DNMT3a e DNMT3b).

A epigenómica pode ser dividida em duas categorias principais:

1. EpigenomaO epigenoma abrange uma vasta gama de modificações químicas que ocorrem no DNA e nas histonas dentro da cromatina, além de alterações estruturais na própria cromatina. Estas modificações, independentes da sequência genómica subjacente, fornecem informações regulatórias críticas. Os seguintes são componentes-chave do epigenoma:

(1) Modificações de DNAInclui 5-metilcitosina (5mC) e 5-hidroximetilcitosina (5hmC).

(2) Modificações de HistonasAbrange modificações como H3K27me3, H3K4me3 e H3K27ac.

(3) Mudanças a Nível da CromatinaEnvolve alterações mediadas por proteínas que se ligam ao DNA, como os fatores de transcrição.

2. EpitranscriptomaEste termo refere-se de forma ampla a todas as modificações pós-transcricionais que não alteram a sequência de RNA em si. Atualmente, mais de 100 modificações químicas diferentes foram identificadas no RNA, incluindo N6-metiladenosina (m6A), N1-metiladenosina (m1A) e pseudouridina (Ψ).

Tecnologias de Sequenciação de Metilação de DNA

A informação de metilação do DNA pode ser perdida durante manipulações padrão de biologia molecular, como clonagem molecular em bactérias e PCR, devido à falta de manutenção das metiltransferases de DNA. Várias técnicas incluem imunoprecipitação de DNA metilado (MeDIP), sequenciação por bisulfito (BS-seq)e sequenciação de bisulfito com representação reduzida (RRBS) foram propostos para preservar a informação de metilação do DNA e, simultaneamente, transformá-la em sinais quantitativos e mensuráveis. Ao combinar com sequenciação de alto rendimentoEstas técnicas forneceram informações abrangentes e fiáveis sobre a metilação do DNA em todo o genoma. Um breve esboço e fluxo de trabalho das diferentes tecnologias de sequenciação de metilação do DNA baseadas em NGS é apresentado na Figura 1 abaixo.

Figure 1. Various NGS-based methods for analyzing DNA methylation (Jeong et al., 2016). Figura 1. Diferentes métodos de análise de metilação de DNA baseados em NGS (Jeong) et al.., 2016).

Em termos do mérito e do viés destes métodos, BS-seq e RRBS pode gerar um metiloma de DNA de baixa resolução, enquanto MeDIP-seq pode apenas gerar enriquecimento relativo de regiões específicas ao longo do genoma. A imunoprecipitação de cromatina (ChIP) oferece uma ferramenta vantajosa para estudar os níveis de metilação de histonas associados a uma região promotora de um gene específico entre tecidos normais e doentes. Identificar os alvos genéticos de proteínas ligadoras de DNA e revelar o mecanismo de interação proteína-DNA é crucial para compreender os processos celulares. A sequenciação de imunoprecipitação de cromatina (ChIP-seq) permite-lhe tirar o máximo proveito dos seus estudos de cromatina com um viés de sequenciação mínimo.

Como Detectar a Metilação de RNA

A metilação do DNA e do RNA envolve a adição enzimática de um grupo metilo (CH3) a um átomo específico na molécula de DNA ou RNA, catalisada por metiltransferases. No RNA celular, já foram identificados mais de 100 tipos de modificações químicas. Entre estas, existem vários tipos de metilação do RNA, incluindo a metilação m6A do RNA, a metilação m5C do RNA, a metilação m1A do RNA e a metilação m7G do RNA. Atualmente, o tipo mais proeminente e enriquecido é a metilação m6A do RNA, que se refere à metilação do átomo de nitrogênio na 6ª posição da adenina em moléculas de RNA (N6-metiladenosina, m6A). Esta modificação é a mais comum entre as modificações pós-transcricionais no mRNA eucariótico, representando 80% das modificações de metilação do RNA.

Figure 2. m6A methylation modifications in eukaryotes (Roundtree et al., 2017).

Os métodos atuais para detectar a metilação de RNA incluem principalmente o seguinte:

Sequenciação MeRIP Sequenciação por Imunoprecipitação de RNA MetiladoEste método baseia-se no princípio da ligação específica de anticorpos a bases metiladas. Utiliza anticorpos específicos para m6A para imunoprecipitar e enriquecer fragmentos de RNA metilados, que são posteriormente submetidos a sequenciação de alto rendimento para identificar modificações m6A. No entanto, este método só consegue identificar regiões com altos níveis de metilação e não consegue alcançar resolução de base única para a metilação do RNA.
miCLIP (Imunoprecipitação e Cross-Linking de Resolução de Nucleotídeos Individuais de Metilação)Nesta técnica, o RNA metilado é especificamente ligado a anticorpos e, em seguida, entrelaçado com luz ultravioleta. A transcrição reversa do RNA entrelaçado resulta em mutações ou truncamentos de cDNA, indicando a presença de m6A. Embora o miCLIP possa identificar a metilação de RNA com resolução de base única, os altos custos associados ao uso de etiquetas isotópicas como o P32 tornam-no menos viável para uso laboratorial rotineiro.
Sequenciação por Nanoporos TecnologiaEsta tecnologia de sequenciação de terceira geração identifica sequências de bases com base em sinais elétricos. Diferentes bases modificadas no RNA causam graus variados de obstrução à medida que passam pelo canal do nanopore, gerando sinais elétricos característicos. Através do monitoramento em tempo real desses sinais, podem ser determinados os tipos de bases correspondentes e suas modificações. Assim, a sequenciação por nanopore pode detetar a metilação do RNA com resolução de base única, sem a necessidade de ligação a anticorpos específicos.

Os Nossos Serviços de Sequenciação em Epigenómica

As nossas soluções de metilação do DNA incluem:

Sequenciação de Bisulfito do Genoma Completo
- A Sequenciação de Bisulfito de Genoma Inteiro fornece uma visão abrangente dos padrões de metilação do DNA em todo o genoma, permitindo a análise de citosinas metiladas e não metiladas.
Sequenciação de Bisulfito Direcionada
- Esta metodologia de sequenciação captura e examina seletivamente regiões genómicas definidas, facilitando a análise precisa e económica dos padrões de metilação do DNA.
Sequenciação de Bisulfito com Representação Reduzida
- A Sequenciação de Bisulfito com Representação Reduzida é um método que se concentra num subconjunto do genoma, oferecendo um equilíbrio entre a cobertura do genoma e a relação custo-eficácia para a análise de metilação do DNA.
Sequenciação MeDIP
- A sequenciação MeDIP facilita o enriquecimento e a análise de fragmentos de DNA metilado, oferecendo informações valiosas sobre os padrões de metilação do DNA e as suas potenciais implicações funcionais.
ChIP-Seq
- A Sequenciação por Imunoprecipitação de Cromatina (ChIP-Seq) é um método poderoso para identificar interações proteína-DNA, elucidar locais de ligação de fatores de transcrição e explorar modificações epigenéticas.
hMeDIP-seq
- A Sequenciação por Imunoprecipitação de DNA Hidroximetilado (hMeDIP-Seq) é utilizada para estudar especificamente a hidroximetilação do DNA, uma marca epigenética crucial envolvida na regulação genética.
ATAC-Seq
- O ATAC-Seq fornece dados sobre a acessibilidade da cromatina, permitindo a identificação de regiões de cromatina abertas e fechadas dentro do genoma.
NGS-BSP
- A Sequenciação de Próxima Geração de DNA Convertido em Bisulfito (NGS-BSP) é um método utilizado para uma análise abrangente da metilação do DNA, oferecendo informações com resolução de uma única base.
Sequenciação de DNA 6mA
- A sequenciação de 6mA do DNA foca na deteção e quantificação de N6-metiladenina (6mA) no DNA, uma marca epigenética emergente.
Serviço DAP-Seq
- A Purificação por Afinidade de DNA Sequenciamento (DAP-Seq) é um método utilizado para revelar interacções entre proteínas e DNA, aumentando assim a nossa compreensão das proteínas que se ligam ao DNA e das suas funções na regulação genética.
oxBS-seq
- A Sequenciação por Bisulfito Oxidativo (oxBS-seq) é um método especializado utilizado para discriminar entre 5-metilcitosina (5mC) e 5-hidroximetilcitosina (5hmC) no DNA, elucidando os seus papéis distintos na regulação epigenética.
Sequenciação de 5mC/5hmC
- O nosso serviço de sequenciação 5mC/5hmC de alto rendimento utiliza várias plataformas maduras e estáveis com alta eficiência, simplicidade e precisão para ajudar a sua investigação em epigenética.

As nossas soluções de metilação de RNA incluir:

Sequenciação MeRIP (Análise de m6A)
- A sequenciação MeRIP foca nas modificações de RNA, particularmente na N6-metiladenosina (m6A), e ajuda a compreender a regulação pós-transcricional e a dinâmica das modificações de RNA.
RIP-Seq
- A Sequenciação por Imunoprecipitação de RNA (RIP-Seq) é utilizada para explorar interações entre RNA e proteínas, fornecendo informações valiosas sobre as funções das proteínas ligadoras de RNA e o seu impacto na funcionalidade do RNA.
Sequenciação de Metilação de 2'-O-RNA
- O serviço de sequenciação de metilação de RNA 2'-O (RiboMeth-seq) oferece uma deteção abrangente de modificações de metilação de RNA 2'-O em uma variedade de moléculas de RNA, incluindo snoRNA, tRNA e rRNA. O RiboMeth-seq utiliza principalmente tratamento alcalino ou de íons metálicos para induzir a clivagem aleatória de RNA. As posições de metilação 2'-O exibem resistência à clivagem, permanecendo assim intactas; ao contrário, os locais não metilados são suscetíveis à clivagem ou degradação. Ao identificar os locais que resistem à clivagem, o RiboMeth-seq mapeia efetivamente os locais de metilação 2'-O.
Sequenciação de Metilação de RNA por Nanoporos
- A sequenciação de metilação de RNA por nanoporo é um método que utiliza a tecnologia de nanoporo para sequenciar diretamente moléculas de RNA e detetar as suas modificações de metilação. Esta técnica permite a localização e identificação precisas dos locais de metilação através da análise em tempo real das mudanças no sinal elétrico à medida que as moléculas de RNA passam pelo nanoporo. Com as vantagens da sequenciação direta e de comprimentos de leitura longos, esta tecnologia serve como uma ferramenta poderosa para investigar os papéis da metilação de RNA na expressão génica e na função celular.

Vantagens da Sequenciação Epigenómica

Perspectivas AbrangentesA investigação em epigenómica fornece uma paisagem abrangente das modificações epigenéticas em todo o genoma, abrangendo a metilação do DNA, modificações das histonas e os papéis regulatórios dos RNAs não codificantes. Esta abordagem holística é fundamental para elucidar redes regulatórias de genes intrincadas e as suas respostas dinâmicas.
Sensibilidade e EspecificidadeTécnicas epigenómicas modernas, como ChIP-seq, Bisulfito-seq, e ATAC-seqoferecem uma sensibilidade e especificidade excecionais. Estas metodologias permitem a deteção e quantificação precisas de alterações subtis nas marcas epigenéticas, essenciais para decifrar processos celulares e mecanismos de doença a nível molecular.
Análise de Alto RendimentoAs metodologias epigenómicas facilitam a análise em alta capacidade de milhares de regiões genómicas e locais epigenéticos simultaneamente. Esta capacidade melhora significativamente a eficiência da pesquisa, apoiando investigações em grande escala sobre sistemas biológicos e interações genéticas complexas.
Resolução Temporal e EspacialFerramentas epigenómicas avançadas fornecem resolução temporal e espacial das modificações epigenéticas, capturando mudanças dinâmicas em várias fases de desenvolvimento e tipos celulares. Esta visão detalhada das dinâmicas epigenéticas contribui de forma crucial para a compreensão da biologia do desenvolvimento e da patogénese de doenças.

Aplicação do Sequenciamento de Epigenómica

Investigação do CancroA epigenómica encontra uma ampla aplicação na investigação do câncer, onde a análise de alterações epigenéticas em células tumorais identifica potenciais biomarcadores e alvos terapêuticos. Isto contribui significativamente para o avanço de estratégias de tratamento personalizadas.
Biologia do DesenvolvimentoEstudar os mecanismos regulatórios epigenéticos durante o desenvolvimento embrionário aumenta a nossa compreensão da diferenciação celular e da organogénese a nível molecular.
NeurociênciaExplorar o papel das modificações epigenéticas no neurodesenvolvimento, na plasticidade sináptica e nas doenças neurodegenerativas revela mecanismos subjacentes aos distúrbios neurológicos.
Ciência AmbientalA epigenómica é utilizada no estudo das influências ambientais, como a dieta, poluentes e estilo de vida, na expressão génica e nas modificações epigenéticas. Isso ajuda a avaliar a relação entre o ambiente e a saúde.
Ciência das PlantasNa investigação epigenética de plantas, a epigenómica revela mecanismos moleculares que governam o crescimento, desenvolvimento e respostas das plantas a fatores de stress ambiental, facilitando a melhoria das culturas e a produtividade agrícola.

Requisitos de Amostra

Abaixo estão os requisitos de amostra para alguns dos nossos serviços de sequenciação epigenómica. Para informações mais detalhadas, consulte as páginas de serviços específicas. Além disso, se estiver interessado nos nossos serviços, por favor contacte-nos para confirmar os requisitos da amostra de sequenciação.

Tabela 1. Sequenciação epigenómica

Serviço	Tipo de Amostra	Quantidade Recomendada	Quantidade Mínima	Concentração Mínima
MeDIP-Seq/hMeDIP-seq	DNA genómico	≥ 2 µg	1 µg	20 ng/μL
WGBS (Bisulfito de Genoma Inteiro) Sequenciação	DNA genómico Célula Tecido	≥ 1 μg ≥ 1 x10⁶ ≥ 50 mg	200 ng	10 ng/µL
RRBS (Bisulfito de representação reduzida) sequenciação)	DNA genómico Célula Tecido	≥ 1 μg ≥ 5 x10⁶ ≥ 30 mg	20 ng 3×10³	20ng/µL
Sequenciação de Bisulfito Direcionada	DNA genómico Célula Tecido	≥ 500 ng ≥ 1 x10⁶ ≥ 20 mg	50 ng	10 ng/µL
oxWGBS-Seq	DNA genómico	≥ 3 µg	1 µg	30 ng/µL
oxRRBS-Seq	DNA genómico	≥ 2 µg		50 ng/μL
oxTBS-Seq	DNA genómico	≥ 1 µg		20 ng/μL
Epityper	DN genómico	≥ 1 µg
DNA 6mA-IP-Seq	DNA genómico	≥ 5 µg		20 ng/μL
ChIP-seq	DNA ChIPado Célula Tecido	≥ 10 ng ≥ 2 x10⁷ ≥ 500 mg	5 ng 1×10⁵	1 ng/µL
DAP-seq	TF Célula Tecido	≥ 5 µg ≥ 5 x10⁶ ≥ 500 mg	1 µg 200 mg	20 ng/µL
ATAC-seq	Célula Tecido	≥ 1 x10⁶ ≥ 500 mg	5×10⁴ 200mg	1 ng/µL

Tabela 2. Sequenciação de Epigenómica de RNA

Serviço	Tipo de Amostra	Quantidade Recomendada	Quantidade Mínima	Concentração Mínima
RIP-seq	RNA de IPed Célula Tecido	≥ 100 ng ≥ 5×10⁷ ≥ 500 mg	40 ng 200 mg	5 ng/μL
eCLIP-Seq	RNA de IPed Célula Tecido	≥ 100 ng ≥ 3×10⁷ ≥ 500 mg	40 ng 200 mg	5 ng/μL
MeRIP (RNA Metilada) Imunoprecipitação	RNA total Célula Tecido	≥ 10 μg ≥ 1×10⁷ ≥ 500 mg	2 μg 200 ng	1 ng/µL
Sequenciação de Bisulfito de RNA (RNA BS-seq)	RNA total Célula Tecido	≥ 10 μg ≥ 1×10⁷ ≥ 500 mg	100 mg

Pipeline de Análise

O fluxo de trabalho de análise de dados de sequenciação em epigenómica segue geralmente o esboço apresentado abaixo. Como cada método envolve passos específicos, pode consultar as secções respetivas para procedimentos detalhados de análise de dados.

The Data Analysis Pipeline of Epigenomics Sequencing.

Exibição de Resultados

Abaixo está uma apresentação parcial dos resultados das nossas análises de sequenciação epigenómica. Para informações mais detalhadas, consulte as páginas de serviços específicas.

The Epigenomics Sequencing Results Display Figure.

Referências

Jeong H.M., et al.Eficiência da sequenciação por bisulfito de imunoprecipitação de DNA metilado para análise de metilação de DNA em genoma completo. Epigenómica. 2016, 8(8):1061-77.
Roundtree I A, Evans M E, Pan T, et al. Modificações Dinâmicas de RNA na Regulação da Expressão Génica. Célula, 2017, 169(7):1187-1200.

Apenas para fins de investigação, não se destina a diagnóstico clínico, tratamento ou avaliações de saúde individuais.

Recursos em Destaque