NGS-BSP

A CD Genomics especializa-se em serviços de NGS-BSP, oferecendo capacidades avançadas para uma análise abrangente. Análise de metilação de DNAO nosso serviço utiliza tecnologia de ponta. tecnologia NGS para mapear e quantificar com precisão as citosinas metiladas, fornecendo informações detalhadas sobre as modificações epigenéticas em várias amostras biológicas. Isso permite uma caracterização precisa dos mecanismos de regulação genética e facilita a investigação de doenças complexas.

A Introdução do NGS-BSP

A metilação do DNA afeta fortemente a estrutura da cromatina e a regulação da expressão génica. Durante muitos anos, a PCR de Sequenciação com Bisulfito (BSP) tem servido como o "padrão ouro" para medir a metilação do DNA em regiões específicas. A BSP possui alta fiabilidade e precisão, e pode determinar com exatidão o estado de metilação de cada local CpG no fragmento. O Sequenciação de Nova GeraçãoA sequenciação por PCR de bisulfito baseada em NGS (NGS-BSP) pode encontrar informações de modificação de metilação mais precisas, sendo aplicável a alguns genes que são regiões de detecção de metilação conhecidas, e também é adequada para explorar regiões de metilação significativas de genes.

Princípio Experimental do BSP:

O DNA genómico é tratado com bisulfito, convertendo todas as citosinas não metiladas em uracilo, enquanto as citosinas metiladas permanecem inalteradas. Subsequentemente, são desenhados primers em ambas as extremidades das ilhas CpG para amplificação por PCR. Os produtos alvo purificados são então clonados utilizando clonagem TA. Cada clone é selecionado para sequenciação a fim de identificar clones positivos. Por fim, as sequências obtidas são comparadas com a sequência original para determinar os locais de metilação e quantificar o grau de metilação.

Figura 1. Princípio Experimental do BSP.

Vantagens do Nosso Serviço de NGS-BSP

• Detetar rapidamente todos os locais de metilação
• Alto rendimento, Alta precisão, Resultados simples e intuitivos
• Mais rentável e que poupa tempo do que o BSP original se estiver a testar muitos amostras.

Aplicações de NGS-BSP

• Pesquisa em Epigenética
• Aplicações Clínicas
• Estudos Ambientais e do Exposoma
• Investigação Agrícola e Pecuária

Fluxo de Trabalho NGS-BSP

Em resumo, os primers BSP foram desenhados utilizando o software online MethPrimer. O DNA genómico (1 µg) foi convertido utilizando o ZYMO EZ DNA Methylation-Gold Kit (ZYMO) e um vigésimo dos produtos de eluição foi utilizado como template para a amplificação por PCR. Para cada amostra, foram gerados produtos BSP de múltiplos genes, agrupados igualmente e submetidos à ligação de adaptadores. Bibliotecas com códigos de barras de todas as amostras foram sequenciadas na plataforma Illumina Hiseq utilizando a estratégia de pares de extremidades de 150 bp.

Especificações do Serviço

	Requisitos de Amostra quantidade de gDNA: ≥ 1 μg; Concentração de DNA ≥ 30 ng/μl, OD260/280=1.8~2.0 Todo o ADN deve ser tratado com RNase e não deve apresentar degradação ou contaminação. Nota: Os montantes de amostra são indicados apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.
Clique	Estratégia de Sequenciação Illumina HiSeq, PE150. Profundidade de cobertura ≥ 100x.
	Análise Bioinformática Fornecemos várias análises de bioinformática personalizadas: Processamento de dados brutos Alinhamento de dados de sequenciação Avaliação da taxa de conversão de bisulfito em dados de sequenciação Análise da profundidade de sequenciamento e cobertura em regiões-alvo Cálculo dos níveis de metilação da citosina (C) Visualização dos níveis de metilação em regiões-alvo Análise estatística da distribuição dos níveis de metilação em regiões-alvo Análise de cluster dos níveis de metilação em regiões-alvo entre múltiplas amostras Análise personalizada Nota: Os dados recomendados e os conteúdos de análise apresentados são apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes em NGS-BSP para a sua escrita (personalização)

A CD Genomics oferece consulta consigo em todas as etapas do processo para garantir que aproveita ao máximo os seus dados. Oferecemos assistência profissional desde o planeamento de experiências até ao sequenciamento e à análise de dados. Se tiver algum requisito, informe-nos e estaremos disponíveis para o ajudar. Adoraríamos ter a oportunidade de trabalhar consigo. Por favor, contacte-nos para mais informações e um orçamento detalhado.

Referências

1. Pan X, Gong D, Nguyen DN, et al.A colonização microbiana precoce afeta a metilação do DNA de genes relacionados com a imunidade intestinal e o metabolismo em porcos prematuros. Pesquisa de DNA, 2018.
2. Zhang S, Shen L, Xia Y, et al.Paisagem de metilação do DNA de depósitos de gordura e composição de ácidos gordos em porcos obesos e magros. Relatórios Científicos, 2016, 6:35063.

Os resultados parciais estão mostrados abaixo:

1. Como é realizado o processo de tratamento com bisulfito?

O tratamento com bisulfito envolve a exposição do DNA ao bisulfito de sódio, levando à desaminação dos resíduos de citosina não metilados a uracilo, enquanto as citosinas metiladas permanecem inalteradas. Esta modificação química permite a diferenciação entre citosinas metiladas e não metiladas durante o sequenciamento, facilitando a análise subsequente dos padrões de metilação do DNA.

2. Quais são as ferramentas comumente utilizadas para a análise de dados de NGS-BSP?

Diversas ferramentas e software especializados são utilizados para a análise de dados de NGS-BSP, incluindo:

• FastQC: para avaliar a qualidade de dados de sequenciação brutos.
• Trim Galore: para remover leituras de baixa qualidade e sequências de adaptadores.
• Bismark: para alinhar leituras tratadas com bisulfito ao genoma de referência e determinar os níveis de metilação do DNA.
• SAMtools: para gerir ficheiros de alinhamento.
• MethylKit: para realizar análises de metilação diferencial e visualizar resultados.
• IGV (Visualizador de Genómica Integrativa): para visualizar padrões de metilação.
• HOMER: para anotar elementos genómicos funcionais.
• Análise KEGG e GO: para elucidar vias biológicas influenciadas por alterações na metilação do DNA.

3. Quais são as principais considerações para a extração de DNA em NGS-BSP?

Para a implementação bem-sucedida de NGS-BSP, a extração de DNA de alta qualidade é um pilar fundamental. É imperativo ter em conta as seguintes considerações:

Empregando técnicas de extração de DNA que fornecem DNA de elevada pureza e integridade. Prevenindo a contaminação com RNA, proteínas ou outras impurezas externas. Garantindo que o DNA esteja presente em quantidade e concentração adequadas para aplicações subsequentes.

4. Como é avaliada a eficiência da conversão de bisulfito?

A eficácia da conversão de bisulfito pode ser avaliada através de vários meios:

• Incorporando DNA de controlo não metilado e garantindo a conversão completa (ausência de citosinas residuais).
• Sequenciação de DNA convertido com bisulfito e determinação da taxa de conversão (percentagem de citosinas não metiladas convertidas em uracilo).
• Empregar controlos spike-in ou padrões internos para monitorizar a eficiência da conversão.

5. Como é que se desenham primers para NGS-BSP?

Desenhar primers para NGS-BSP exige atenção especial devido às modificações na sequência induzidas pelo tratamento com bisulfito:

• Elaborar primers isentos de citosinas para acomodar a sua conversão em uracilos (que se transformam em timinas após a PCR).
• Aproveitando ferramentas de software como o MethPrimer ou o BiSearch para a criação de primers específicos para bisulfito.
• Verificação da eficiência e especificidade dos primers através da validação com DNA tratado com bisulfito.

Mudanças na metilação do promotor na placenta envolvidas na relação entre depressão prenatal e pequeno para a idade gestacional

Revista: BMC Gravidez e Parto

Fator de impacto: 3,105

Publicado: 02 de Outubro de 2022

Fundo

A depressão e a ansiedade durante a gravidez afetam entre 10% a 40% das mulheres grávidas e estão ligadas ao baixo peso ao nascer e ao crescimento intrauterino restrito (CIR). O aumento dos níveis de glucocorticoides devido à disfunção do eixo HPA pode impactar o desenvolvimento fetal através da placenta, que regula a exposição aos glucocorticoides através da HSD11β2. Os hormónios da tiróide (eixo HPT) e a melatonina (eixo HPA) também desempenham papéis. As emoções maternas podem causar alterações epigenéticas na placenta. Este estudo irá utilizar sequenciação de nova geração e Análise de metilação do DNA técnicas para examinar a relação entre SGA e emoções maternas, investigando especificamente alterações de metilação em genes como CRH, HSD11β2, SLC16A10, DIO3 e MTNR1B.

Materiais e Métodos

Resultados

Um estudo de caso-controle aninhado descobriu que a depressão materna no segundo trimestre é um fator de risco para SGA. As placentas foram divididas em quatro grupos com base no estado de depressão e SGA, com 17 amostras cada. Os níveis de metilação dos genes CRH e DIO3 eram mais elevados em mães deprimidas, enquanto os níveis de HSD11β2 eram mais elevados em mães não deprimidas. A metilação de CRH e HSD11β2 correlacionou-se com a depressão, e a metilação de DIO3 correlacionou-se com SGA, sugerindo que a depressão materna pode influenciar o desenvolvimento fetal através dessas alterações epigenéticas.

Figura 1. Metilação dos genes CRH, HSD11β2, SLC16A10, DIO3 e MTNR1B na placenta.

Figura 2. Comparação dos níveis de metilação dos genes placentários (CRH, HSD11β2, DIO3, SLC16A10 e MTNR1B) em quatro grupos.

Figura 3. Comparação do nível de metilação de CRH, HSD11β2, DIO3, SLC16A10, MTNR1B de acordo com a depressão da mãe e o nascimento SGA.

Conclusão

A depressão materna no segundo trimestre perturba os eixos HPA e HPT, aumentando o risco de SGA através de alterações na metilação genética placentária (DIO3, HSD11β2, CRH). A triagem e intervenção precoces são cruciais devido aos potenciais efeitos a longo prazo no comportamento e desenvolvimento da prole. Os profissionais de saúde devem priorizar o apoio emocional para as mulheres grávidas e monitorizar a prole de mães deprimidas quanto a impactos no desenvolvimento. Aumentar os tamanhos das amostras em futuras pesquisas melhorará a validade destes achados.

Referência

1. Yang J, Xu A, Zhang Y, et al. Alterações na metilação do promotor na placenta envolvidas na relação entre depressão prenatal e pequeno para a idade gestacional. BMC Gravidez e Parto2022, 22(1):741.