Diretrizes para Submissão de Amostras
Por que a Sequenciação de Nanoporos Ultra-Longa é Importante
O sequenciamento convencional muitas vezes deixa lacunas não resolvidas, particularmente em genomas com repetições extensas, poliploidia ou alta complexidade estrutural. Essas lacunas limitam a precisão das montagens genómicas e reduzem a confiança nas análises subsequentes.
Sequenciação ultra longa por nanopore aborda estas limitações gerando leituras de ADN muito mais longas do que as abordagens standard. Ao contrário do sequenciamento de comprimento curto ou médio, que enfrenta dificuldades em regiões altamente repetitivas, as leituras ultra longas podem abranger centrómeros, telómeros e variantes estruturais numa única extensão.
Esta capacidade transformou a investigação genómica. Estudos em plantas e animais agora alcançam rotineiramente montagens telómero-a-telómero (T2T), permitindo que os investigadores explorem a arquitetura genética com uma resolução sem precedentes. Para a investigação aplicada em melhoramento de culturas, descoberta biomédica e evolução microbiana, a capacidade de resolver genomas completos oferece uma vantagem competitiva direta.
O sequenciamento do genoma completo revela fatores de virulência, elementos genéticos móveis e potencial transmissão ambiental de estirpes bacterianas em ambientes de explorações pecuárias. (Rivu, Supantha, et al., 2024)
Parâmetros Técnicos
| Parâmetro | Especificação |
|---|---|
| Comprimento de leitura | N50 >50–100 kb; leituras máximas >4 Mb |
| Requisito de entrada | ≥6 milhões de células (PBMCs, células cultivadas ou tecido congelado) |
| Química | Kit de Sequenciação Ultra-Longa Nanopore (SQK-ULK114, Kit 14, nanopore R10.4.1) |
| Plataforma | PromethION / GridION |
| Vazão | Até 90–100 Gb por célula de fluxo PromethION |
| Precisão | Leitura bruta Q20+ (Química Kit 14) |
| Tempo de preparação | ~200 minutos mais eluição durante a noite |
| Métodos de QC | Qubit, Nanodrop, eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) |
| Armazenagem e logística | Kits enviados a 2–8 °C; armazenamento a longo prazo a –20 °C |
Vantagem: Destaques do Serviço CD Genomics
A CD Genomics oferece um serviço de sequenciação ultra longa por nanopore de ponta a ponta que combina protocolos de laboratório avançados com plataformas de sequenciação comprovadas. A nossa abordagem é projetada para maximizar o comprimento de leitura, a estabilidade e a precisão, permitindo que os investigadores fechem lacunas e produzam montagens altamente contíguas.
Principais Vantagens do Serviço
- Montagens sem lacunas: O sequenciamento de DNA nanopore ultra longo abrange regiões repetitivas e ricas em GC, eliminando lacunas na montagem.
- Descoberta de variantes estruturais: Leituras longas detetam inserções grandes, deleções, inversões e expansões de repetições com confiança.
- Resolução do genoma poliploide: Estratégias otimizadas validam a fase de haplótipos em espécies complexas.
- Análise telómero-a-telómero: O sequenciamento de leitura longa por nanopore apoia montagens completas T2T em plantas e animais.
- Química optimizada: A utilização do Kit de Sequenciação Ultra-Longa Nanopore (SQK-ULK114) com o Kit 14 garante um elevado rendimento e qualidade de leitura bruta Q20+.
- Aplicações flexíveis: Compatível com ADN genómico e integrado com soluções de sequenciação de RNA por nanopore a jusante.
- SOPs proprietárias para a extração de DNA de ultra-alto peso molecular de amostras de plantas, animais e microrganismos.
- Melhorias no fluxo de trabalho na reparação de DNA e construção de bibliotecas que preservam o comprimento dos fragmentos >100 kb.
- Acesso às plataformas PromethION e GridION com a mais recente química Kit 14 para precisão Q20+.
Evidência de Caso Provada
| Projeto | Estratégia / Saída de Dados | Resultados Chave |
|---|---|---|
| Montagem do genoma do trigo | HiFi + ONT leituras ultra longas | O N50 do contig melhorou de 341 kb para 2,15 Mb; referência quase sem lacunas alcançada. |
| Validação do genoma da cana-de-açúcar | Leituras de nanoporo ultra longas para verificação de haplótipos | Taxa de erro de comutação tão baixa quanto 0,05/Mb; >90% de precisão de mapeamento |
| Genoma T2T de pimenta chili | Quatro células de fluxo PromethION; comprimento de leitura N50 de até 107 kb. | N50 médio = 91,5 kb; leitura mais longa 2,98 Mb; montagem T2T completa |
| Montagem do genoma de sorgo | Sequenciação ultra longa ONT apenas (sem Illumina/PacBio) | Montagem completa de telómero a telómero; centrómeros e telómeros validados. |
Principais Aplicações
Montagem de genoma de novo
Leituras ultra longas abrangem elementos repetitivos e regiões ricas em GC, fechando lacunas que permanecem não resolvidas com sequenciação de leituras curtas ou longas padrão.
Deteção de variação estrutural
A sequenciação de leitura longa por nanopore identifica grandes inserções, deleções, inversões e expansões de repetições que influenciam a estabilidade do genoma e o fenótipo.
Análise de genoma poliploide
Sequenciação de DNA nanopore ultra longa melhora o agrupamento de haplótipos e valida montagens em plantas poliplóides e espécies híbridas.
Montagem telómero a telómero (T2T)
Assemblagens completas a nível de cromossoma são alcançadas ao abranger telómeros, centrómeros e regiões de rDNA com leituras únicas.
Transcriptoma e sequenciação de RNA integração
Combinado com Sequenciação de RNA Direta por Nanoporos e Sequenciação de Transcritos de Comprimento Total com Nanoporosos investigadores podem ligar a estrutura do genoma à atividade transcricional.
Fluxo de Trabalho: Serviço de Ponta a Ponta
A CD Genomics oferece um fluxo de trabalho completo para sequenciação ultra longa por nanopore, desde a preparação da amostra até à entrega final dos dados. Cada etapa é otimizada para preservar o DNA de ultra-alto peso molecular e maximizar o comprimento das leituras.
1. Preparação da amostra
- Apoio a amostras de plantas, animais e microrganismos
- Protocolos especializados para minimizar a degradação e remover polissacarídeos ou metabolitos secundários.
2. Extração de ADN e QC
- Extração de DNA de ultra-alta massa molecular (uHMW)
- Verificações de qualidade utilizando Qubit, Nanodrop e eletroforese em gel de campo pulsado.
3. Preparação da biblioteca
- Kit de Sequenciação Ultra-Longa Nanopore (SQK-ULK114) com química Kit 14
- Fragmentação baseada em transposase e rápida ligação de adaptadores
- Eluição noturna para preservar moléculas de DNA longas
4. Sequenciação
- Realizado nas plataformas PromethION ou GridION
- Alcançar comprimentos de leitura >100 kb N50, com leituras máximas a exceder 4 Mb.
5. Análise bioinformática
- Basecalling em tempo real e filtragem de qualidade
- Montagem, polimento e deteção de variantes
- Suporte opcional de montagem telómero-a-telómero (T2T)
6. Relato e entrega
- Ficheiros FASTQ e BAM com métricas de QC
- Relatórios de análise personalizados para montagem de genoma ou estudos de variantes estruturais
Análise Bioinformática
Análise Básica
| Fase de Análise | Descrição |
|---|---|
| Chamadas de base | Converte sinais elétricos brutos em sequências de DNA/RNA utilizando modelos como o Dorado para uma maior precisão. |
| Controlo de Qualidade (CQ) | Inclui a distribuição do comprimento das leituras, métricas de cobertura e pontuações de qualidade. |
| Montagem de Novo | Constrói montagens genómicas de alta contiguidade utilizando ferramentas otimizadas para leituras longas (por exemplo, Flye, Canu). |
| Polimento e Correção de Erros | Refina perfis de erro de montagem utilizando autocorreção de leituras longas ou fluxos de trabalho de polimento híbrido. |
Análise Avançada
| Fase de Análise | Descrição |
|---|---|
| Chamada de Variantes Estruturais | Deteta grandes indels, duplicações, inversões usando ferramentas como Sniffles ou CuteSV. |
| Faseamento de Variantes e Anotação de SV | As variantes de fases ao longo de contigs longos e anota SVs para interpretação biológica. |
| Suporte Telómero-a-Telómero (T2T) | Completa montagens a nível de cromossoma fechando lacunas em repetições, centrómeros e telómeros. |
| Deteção de Modificações Epigenéticas e de Bases | Deteta modificações de DNA/RNA (por exemplo, 5mC, m6A) usando Remora ou Megalodon durante a chamada de bases. |
| Classificação Metagenómica / Taxonómica | Classifica leituras em amostras mistas utilizando fluxos de trabalho como os meta pipelines EPI2ME. |
Entregáveis
Os clientes receberão:
- Dados de sequenciação bruta (formato FASTQ)
- Relatório de controlo de qualidade (distribuição do comprimento de leitura, N50, rendimento, precisão)
- Resultados de montagem de genoma e análise de variantes opcionais
- Relatório de resumo do projeto
Requisitos de Amostra para Sequenciação Ultra-longa por Nanopore
Para garantir resultados de sequenciação ótimos, necessitamos das seguintes condições de amostra:
| Tipo de Amostra | Tipo de Tecido | Requisito (por célula) | Observações |
| Animal | Sangue de Mamífero | ≥5 mL |
|
| Eritrócito Nucleado no Sangue (Peixes, Répteis, Anfíbios, Aves/Aves de Capoeira) | ≥100 μL | ||
| Células | ≥6×10⁷ |
|
|
| Vísceras | ≥0,5 g | Tipo de amostra menos eficaz, difícil de alcançar N50 >100 Kb | |
| Músculo | ≥3 g | ||
| Planta | Jovens Folhas Tenras | ≥3 g |
2. Enxaguar com água estéril 3. Secar e congelar rapidamente |
A nossa equipa fornece orientações sobre a preparação de amostras para o ajudar a alcançar os melhores resultados.
Demonstração de Resultados
Distribuição do comprimento de leitura
O gráfico acompanhante (da Oxford Nanopore Technologies) ilustra como sequenciação ultra-longa estende dramaticamente o comprimento da leitura em comparação com os métodos de ligadura padrão—produzindo uma cauda suave que atinge várias centenas de quilobases.
Impacto do genoma do trigo
A incorporação de leituras ONT ultra-longas aumentou o contig N50 de 341 kb a 2,15 Mb, levando a uma montagem quase sem lacunas, ideal para investigação genómica e programas de melhoramento.
Avanço T2T em plantas
Em projetos recentes de genoma de plantas, protocolos de extração e biblioteca otimizados forneceram leituras ultra-longas com um N50 até 440 kb, melhorando significativamente a automatização telómero-a-telómero (T2T) assembleia.
Sucesso na montagem do sorgo
A genoma completo de sorgo T2T foi montado utilizando apenas sequenciação ultra-longa da ONT, demonstrando a capacidade do método para resolver cromossomas inteiros sem necessidade de tecnologias complementares.
FAQ (Perguntas Frequentes)
Q: Que comprimento de leitura posso esperar da sequenciação ultra-longa por nanopore?
Pode esperar comprimentos de leitura N50 tipicamente variando entre 50 e mais de 100 kb, e em condições ótimas leituras individuais podem ultrapassar 4 Mb—leituras ultra-longas permitem a resolução de regiões genómicas complexas como repetições e centrómeros.
P: Por que é que o comprimento de leitura ultra-longo é importante para a montagem do meu genoma?
Leituras ultra-longas abrangem regiões altamente repetitivas ou estruturalmente complexas, permitindo montagens sem lacunas ou quase sem lacunas, como os genomas T2T, e melhorando a deteção de variantes estruturais que leituras mais curtas não conseguem resolver.
Q: Que impacto têm as leituras longas na deteção de variantes estruturais?
Leituras longas de nanoporos melhoram a descoberta de grandes inserções, deleções, inversões e expansões de repetições ao abarcá-las diretamente, o que simplifica a chamada de variantes e reduz a ambiguidade.
P: A tecnologia de sequenciação por nanoporo pode lidar com amostras de DNA e RNA?
Sim, a sequenciação por nanoporo suporta a sequenciação direta de moléculas de DNA e RNA sem a necessidade de amplificação ou rotulagem, o que permite estudar transcritos e modificações de bases juntamente com a estrutura do genoma.
Q: Quais são os fatores que afetam a qualidade da amostra para leituras ultra-longas?
A pureza do DNA e o comprimento dos fragmentos são críticos. A extração de alta qualidade com mínima degradação é essencial, e podem ser necessárias várias tentativas de extração para obter DNA de ultra-alto peso molecular adequado para sequenciação de leituras ultra-longas.
Q: A tecnologia de nanoporo é adequada para aplicações de campo ou portáteis?
Sim, porque os sequenciadores de nanoporo podem processar DNA ou RNA nativo em tempo real em formatos escaláveis—desde dispositivos MinION portáteis até plataformas de alto rendimento—esta flexibilidade suporta aplicações em laboratório, em campo e remotas.
Estudo de Caso: Montagem do Genoma Humano com Leituras Ultra-Longas de Nanopore
1. Contexto
o genoma humano tem aproximadamente 3,1 Gb de tamanho e contém extensas regiões repetitivas, duplicações segmentares e heterozigose, tornando difícil a sua montagem utilizando sequenciação de leituras curtas. As tecnologias convencionais não conseguem resolver centrômeros, telômeros e variantes estruturais, deixando lacunas persistentes em genomas de referência. Este estudo de caso explora como sequenciação ultra longa por nanopore pode superar estas barreiras.
2. Métodos
Os investigadores sequenciaram o linha celular humana GM12878 (Utah/CEPH pedigree) no Oxford Nanopore MinION plataforma com química 1D R9.4. Os protocolos de preparação de DNA foram concebidos para minimizar a fragmentação e preservar fragmentos de peso molecular ultra-alto.
- Dados gerados: 91,2 Gb de sequência (~30× cobertura) de 39 células de fluxo
- Leituras ultra-longas: N50 >100 kb; comprimento máximo da leitura 882 kb
- Ferramenta de montagem: montador Canu com polimento de leituras curtas Illumina para melhoria da precisão.
3. Resultados
- Montagem apenas com nanopores NG50 = ~3 Mb
- Adicionando 5× cobertura ultra-longa dobrou o NG50 para 6,4 Mb.
- Complexo maior de histocompatibilidade (MHC) (4 Mb) resolvido em um único contig
- 12 grandes lacunas (>50 kb) no GRCh38 foram fechadas.
- Precisão final após polimento = 99,88%
- Leituras ultra-longas permitiram a fase de haplótipos em todo o locus MHC.
Gráfico de cromossomas ilustrando como o sequenciamento ultra longo por nanopore fechou 12 lacunas no GRCh38, incluindo o locus MHC de 16 Mb. Blocos de cor contínua representam montagem contígua, enquanto lacunas brancas indicam regiões não resolvidas.
4. Conclusões
Este estudo demonstra que sequenciação de leitura ultra longa por nanopore permite montagens do genoma humano altamente contíguas. A tecnologia resolveu loci complexos, fechou lacunas de referência e forneceu faseamento de haplótipos em escala cromossómica. Estes resultados destacam o seu potencial para produzir montagens quase completas de telómero a telómero (T2T) e avançar tanto na genómica fundamental como nas aplicações translacionais.
Referências:
- Lu D, Liu C, Ji W, Xia R, Li S, Liu Y, Liu N, Liu Y, Deng XW, Li B. Sequenciação ultra-longa por nanopore e amostragem adaptativa impulsionam a montagem completa do genoma de planta de telômero a telômero.. Planta Mol. 4 de novembro de 2024; 17(11):1773-1786. doi: 10.1016/j.molp.2024.10.008. Publicado online em 16 de outubro de 2024. PMID: 39420560.
- Prall, T.M., Neumann, E.K., Karl, J.A. et al. Sequenciação de DNA ultra-longa consistente com pipetagem lenta automatizada. BMC Genómica 22, 182 (2021).
- Jain M, Koren S, Miga KH, Quick J, Rand AC, Sasani TA, Tyson JR, Beggs AD, Dilthey AT, Fiddes IT, Malla S, Marriott H, Nieto T, O'Grady J, Olsen HE, Pedersen BS, Rhie A, Richardson H, Quinlan AR, Snutch TP, Tee L, Paten B, Phillippy AM, Simpson JT, Loman NJ, Loose M. Sequenciação e montagem de um genoma humano com leituras ultra-longas por nanopore. Nat Biotechnol. 2018 Abr;36(4):338-345. doi: 10.1038/nbt.4060. Epub 2018 Jan 29. PMID: 29431738; PMCID: PMC5889714.
