Diretrizes para Submissão de Amostras
Construa clones iPSC editados com QC suportado por sequenciação desde o início.
A edição genética em células-tronco pluripotentes induzidas pode apoiar a modelagem de doenças, a geração de controlos isogénicos, a genómica funcional e o desenvolvimento de modelos para descoberta de fármacos. Mas um projeto de iPSC editadas raramente é apenas uma tarefa de edição. A sua equipa também precisa de validação a nível de clones, rastreamento de amostras, evidência de sequenciamento e um plano de controlo de qualidade claro antes de os experimentos subsequentes começarem.
A nossa solução de edição genética e controlo de qualidade de iPSCs foi concebida para o ajudar a planear o projeto como um fluxo de trabalho conectado. Ajudamo-lo a pensar no objetivo da edição, sequência alvo, modelo doador, estratégia de triagem, validação do local alvo, controlo de qualidade genómico opcional e entregáveis prontos para relatório antes de as células ou o DNA extraído entrarem no projeto.
O que esta solução o ajuda a responder.
- A minha linha de iPSC é adequada para o objetivo de edição planeado?
- Deve o projeto utilizar uma estratégia de KO, KI, mutação pontual, correção ou reporter?
- É necessário um modelo de doador?
- Quais clones contêm a edição pretendida?
- A confirmação por Sanger é suficiente ou deve-se adicionar sequenciação de amplicon, direcionada ou do genoma completo?
- Quais saídas de QC são necessárias antes da modelagem de doenças a montante, diferenciação ou estudos funcionais?
O objetivo é ajudar a sua equipa a passar de "precisamos de um clone editado" para "entendemos qual clone é melhor suportado por evidências de sequenciação e QC."
Por que os projetos de iPSC editados precisam de mais do que a confirmação do local-alvo
A confirmação do local-alvo é importante, mas pode não ser suficiente para todos os projetos de iPSC editados. Um clone pode parecer correto através de uma PCR curta ou de uma leitura Sanger, enquanto ainda requer uma revisão mais aprofundada do estado do alelo, de eventos maiores no alvo, da estrutura de inserção do doador, de alterações no número de cópias ou de outros sinais de controlo de qualidade em todo o genoma.
Isso não significa que todos os projetos necessitam da mesma profundidade de QC. Significa que o QC deve corresponder ao propósito do clone editado. Um rastreio exploratório rápido pode não precisar do mesmo pacote de evidências que um modelo de doença isogénico de alto valor ou um clone destinado a estudos de diferenciação a longo prazo.
Ajudamos a definir essa profundidade de QC desde cedo, para que os resultados finais sejam mais fáceis de rever e de utilizar.
As nossas capacidades de serviço para projetos de iPSC editados
Apoiamo projetos de iPSC editados como fluxos de trabalho integrados de design, validação, sequenciação, controlo de qualidade e relatórios. Dependendo do âmbito do projeto, a nossa equipa pode ajudar com o planeamento da estratégia de edição, lógica de triagem de clones, validação de locais-alvo, controlo de qualidade suportado por sequenciação e interpretação bioinformática.
Objetivos de edição que podemos ajudar a planear
- Knock-out de genes para modelagem de perda de função
- Inserção knock-in ou de reportador
- Introdução à mutação pontual
- Correção de mutações associadas a doenças
- Geração de controlo isogénico
- Edição suportada por modelo de doador
- Validação do genótipo a nível de clone
- QC suportado por sequenciação antes da investigação a montante
Para cada projeto, o objetivo de edição deve estar ligado a uma estratégia de validação. Um clone knockout pode exigir interpretação de indels ao nível do alelo, enquanto uma inserção knock-in ou de um reportador pode necessitar de validação de junções e confirmação da sequência do doador.
Módulos de triagem e validação de clones
- Coleção e rastreamento de clones de candidatos
- Revisão do estado de expansão de clones
- Genotipagem do local-alvo
- Sequenciação Sanger ou de amplicão onde apropriado
- Sequenciação direcionada para uma revisão de edição de maior resolução
- Inserção de doador ou confirmação de junção
- Tabela de comparação de clones
- Sinalização de QC e notas de relatório
Estes módulos ajudam a sua equipa a comparar clones de uma forma estruturada, em vez de rever ficheiros dispersos.
Opções de QC e reporte suportadas por sequenciação
Para projetos selecionados, o controlo de qualidade suportado por sequenciação pode ir além do local-alvo. Dependendo do objetivo do estudo, os complementos opcionais podem incluir revisão de candidatos fora do alvo, controlo de qualidade suportado por sequenciação do genoma completo, análise de CNV/SNV/SV ou revisão de grandes eventos no alvo.
Para serviços relacionados, veja o nosso Análise de Edição CRISPR com NGS, Sequenciação de Validação de Alvos Indesejados do CRISPRe Sequenciação CRISPR páginas.
Escolha a estratégia de edição e controlo de qualidade certa para a sua linha de iPSC.
Não existe um único plano de QC que se adapte a todos os projetos de iPSC editados. A estratégia certa depende do objetivo da edição, do design do doador, do número de clones, da utilização posterior e de quão contextualizado o seu grupo precisa estar em relação ao genoma.
| Estratégia | Pergunta Principal | Objetivo de Edição de Melhor Ajuste | Método de Validação | Profundidade de QC | Limitação |
|---|---|---|---|---|---|
| Nocaute | O gene alvo foi interrompido? | Modelo iPSC de perda de função | Sanger, sequenciação de amplicons ou sequenciação direcionada | Validação do local-alvo e comparação de clones | Pode ser necessária uma interpretação ao nível do alelo. |
| Knock-in | O sequenciamento doador foi inserido corretamente? | Inserção de repórter, inserção de tag, adição de sequência funcional. | PCR de junção, sequenciação de amplicons ou sequenciação direcionada | Revisão da inserção do doador e da junção | O design do doador afeta a complexidade da triagem. |
| Mutação Pontual | A alteração de base pretendida foi introduzida? | Modelagem de mutações de doenças | Sequenciação de amplicons ou sequenciação direcionada | Confirmação ao nível do alelo | Edições de baixa frequência requerem uma triagem cuidadosa de clones. |
| Correção de Mutação | A variante associada à doença foi corrigida? | Geração de controlo isogénico | Sequenciação do local-alvo e comparação de clones | Revisão do estado do local-alvo e do alelo | Pode ser necessária uma QC adicional para clones de alto valor. |
| Inserção de Repórter | O repórter foi inserido no quadro e no local correto? | Linha de iPSC Reporter | Validação de junções e sequenciação | Planeamento de expressão no local-alvo e a jusante | Não substitui o QC do estado da célula. |
| QC Suportado por WGS | Estão presentes alterações genómicas mais amplas? | Revisão de clones de alto valor antes de estudos subsequentes | Sequenciação do genoma completo e bioinformática | Revisão a nível genómico, contexto de CNV/SNV/SV onde aplicável | Nem sempre é necessário para cada clone de pesquisa. |
Para validação do local-alvo, Sequenciação de Região Alvo pode apoiar uma revisão focada. Para uma avaliação mais ampla em todo o genoma, Sequenciação do Genoma Completo pode ser considerado quando o projeto requer um controlo de qualidade mais aprofundado.
Comece com a edição que precisa e o experimento subsequente que planeia realizar. Se o clone editado for utilizado para trabalho exploratório inicial, a validação do local de edição e a comparação de clones podem ser suficientes. Se o clone apoiar modelagem de doenças, estudos de controlo isogénico ou experiências de diferenciação a longo prazo, um pacote de QC mais aprofundado pode ser útil.
Um projeto de doador-modelo deve incluir revisão do design do doador e confirmação da junção. Um projeto de mutação pontual ou correção pode necessitar de sequenciação a nível de alelo. Um clone destinado a um uso mais amplo a montante pode precisar de QC a nível genómico ou revisão de candidatos fora do alvo.
Ajudamo-lo a escolher o nível de validação que se adequa ao objetivo da pesquisa, sem transformar cada projeto num fluxo de trabalho desnecessariamente pesado.
Fluxo de trabalho de amostra para relatório com pontos de controlo de QC a nível de clone
O nosso fluxo de trabalho liga a edição de design, triagem de clones, validação de sequências e relatórios de controlo de qualidade. Cada etapa é projetada para reduzir a incerteza antes que o projeto avance para a próxima fase.
Passo 1: Receção do projeto e revisão dos objetivos de edição
Começamos por rever o gene alvo ou a região genómica, o tipo de edição, a fonte de iPSC e o background da linha celular, informações sobre o molde ou construção doador, quando aplicável, o uso de investigação subsequente, a profundidade de validação desejada, o número de clones a ser analisados e os resultados esperados.
Este passo ajuda-nos a definir se o projeto necessita apenas de validação do local-alvo, comparação de clones, revisão de candidatos fora do alvo, controlo de qualidade a nível genómico ou um pacote combinado.
Passo 2: Edição do design, planeamento do RNA guia e do modelo doador
O design de edição deve corresponder ao resultado pretendido. Projetos de knockout podem focar na criação de indels de mudança de quadro ou disruptivos. Projetos de knock-in e de reportagem requerem planeamento do template doador e validação das junções. Projetos de mutação pontual ou correção requerem uma confirmação cuidadosa ao nível da sequência.
Nesta fase, o RNA guia, o modelo doador, a sequência-alvo e a lógica de triagem são revistos em conjunto. Isso ajuda a reduzir o risco de projetar uma edição que é tecnicamente possível, mas difícil de validar posteriormente.
Passo 3: Entrega, recuperação e triagem monoclonal
O plano de entrega e recuperação depende da linha de iPSC e da estratégia de edição. As linhas de iPSC podem ser sensíveis ao stress de edição, ao manuseio de células únicas e à expansão de clones. A triagem monoclonal ajuda a separar clones candidatos e permite que cada clone seja analisado de forma independente.
Uma vez que os clones estejam disponíveis, a identidade da amostra, a rotulagem dos clones, o estado de expansão e a disponibilidade de ADN tornam-se pontos de controlo de QC importantes.
Passo 4: Validação do local-alvo e comparação de clones
A validação do local-alvo verifica se a edição pretendida está presente. Dependendo do projeto, isso pode incluir sequenciação Sanger, sequenciação de amplicões, sequenciação direcionada, confirmação de junção, revisão a nível de alelos ou suporte à inserção do doador.
A comparação de clones reúne os resultados. Em vez de analisar cada clone isoladamente, a sua equipa pode comparar o genótipo, o padrão de edição, a zigosidade, o estado da inserção do doador, as bandeiras de QC e a qualidade de sequenciação numa única tabela.
Passo 5: QC a nível do genoma, bioinformática e entregas finais
Para projetos selecionados, o QC adicional pode incluir revisão suportada por sequenciação do genoma completo, validação de candidatos fora do alvo, análise de CNV/SNV/SV ou revisão de grandes eventos no alvo. A análise bioinformática organiza estes resultados em tabelas, resumos visuais e notas de relatório.
Os entregáveis finais podem incluir informações de clones editados, dados de sequenciação, resumos de QC, tabelas de comparação de clones, figuras e notas de análise.
Requisitos de amostra e informação do projeto
As necessidades de amostras dependem de se a sua equipa solicitar edição de design, validação de clone, QC apenas de sequenciamento, revisão a nível do genoma ou um pacote combinado. A tabela abaixo utiliza as orientações de submissão de amostras da CD Genomics como base para submissões de ácidos nucleicos e células. Os requisitos finais devem ser confirmados durante a revisão do projeto.
| Tipo de Entrada | Material Recomendado | Verificação de Qualidade | Container ou Formato | Envio ou Submissão | Notas |
|---|---|---|---|---|---|
| Linha de iPSC existente ou células congeladas | Específico para o projeto; para a submissão geral de células, a orientação da CD Genomics indica uma entrada de células de 1×10.6 células | Identidade celular, viabilidade, histórico de passagem, estado de micoplasma se disponível. | Cryovial ou formato de células congeladas aprovado | gelo seco | Usado para editar a revisão de viabilidade ou o planeamento da extração de DNA/RNA. |
| Clones de iPSC editados / pellets celulares | Específico do projeto; células suficientes para extração de DNA genómico e validação de clones. | Identidade do clone, rotulagem de amostras, estado de expansão, rendimento de DNA após extração. | Cryovial ou tubo de pellet celular | gelo seco | Utilizado para validação do local-alvo, comparação de clones e revisão de QC. |
| DNA genómico extraído para validação do local-alvo ou clone | Para projetos de sequenciação de DNA focados, utilize o requisito específico do ensaio; as entradas de leituras curtas no estilo WES/WGS normalmente começam a partir de ≥500 ng de gDNA. | OD260/280 próximo de 1.8-2.0; tratado com RNase; sem degradação ou contaminação óbvias. | Tubo livre de DNase; água livre de DNase, tampão de eluição ou Tris 10 mM pH 8.0 | Compressas de gelo | Útil para sequenciação direcionada, validação de clones ou QC focado. |
| DNA genómico extraído para QC suportado por WGS | WGS: recomendado ≥500 ng, mínimo 200 ng, concentração mínima 10 ng/µL; WGS sem PCR: recomendado ≥1 µg, mínimo 500 ng, concentração mínima 20 ng/µL | Concentração por fluorometria quando possível; se usar Nanodrop, pode ser necessário um maior input. | tubo livre de DNase | Compressas de gelo | Usado quando é necessária uma QC genómica mais abrangente. |
| DNA genómico extraído para revisão estrutural de longas leituras | PacBio WGS: ≥3 µg, 80 ng/µL; Nanopore WGS: ≥5 µg, 20 ng/µL | DNA de alto peso molecular, baixa degradação, pureza adequada | tubo livre de DNase | Compressas de gelo | Considere quando o contexto estrutural de longo alcance é importante. |
| Amplicão purificado para validação focada | Sequenciação de amplicons: recomendado ≥1 µg, mínimo 500 ng, concentração mínima 20 ng/µL | Produto único esperado, se aplicável; verificação de concentração e pureza. | Tubo de baixa ligação ou tubo livre de DNase | Compressas de gelo | Útil para confirmação no local-alvo, junção do doador ou a nível de clonagem. |
| Edição de ficheiros de design | Gene-alvo, sequência de referência, gRNA, template doador, mapa do plasmídeo, lista de clones | Precisão da sequência e consistência da identificação da amostra | FASTA, GenBank, folha de cálculo, mapa de plasmídeo ou folha de projeto | Submissão eletrónica | Necessário antes da revisão do método e configuração do relatório. |
A CD Genomics também pede aos clientes que submetam um formulário de submissão de amostras preenchido, mantenham os nomes das amostras consistentes entre o formulário e os rótulos das amostras, e forneçam dados de QC eletrónicos quando disponíveis. As amostras em tubos de centrifugação de 1,5 mL devem ser seladas cuidadosamente; células e amostras congeladas devem ser enviadas com gelo seco.
Análise bioinformática e entregáveis
A bioinformática ajuda a transformar dados de sequenciação em evidências de controlo de qualidade a nível de clones. É especialmente importante quando o seu projeto inclui sequenciação de amplicões, sequenciação direcionada, validação de candidatos fora do alvo, controlo de qualidade suportado por WGS ou comparações entre múltiplos clones.
Entregas mínimas
- Edição de notas de revisão de design onde incluído.
- Resumo de QC a nível de amostra e clonagem
- Resumo da validação do local-alvo
- Perfil de alelos ou indels onde aplicável
- Tabela de comparação de clones
- Resumo da QC de sequenciação
- Tabela de validação off-target do candidato onde incluído
- Resumo de QC a nível do genoma onde o WGS está incluído.
- Saídas de revisão de CNV/SNV/SV onde aplicável
- Notas do relatório final
Para análise e relatórios personalizados, consulte o nosso Bioinformática serviços.
Adicionais opcionais
- Análise de sequenciação de amplicons
- Validação de candidatos fora do alvo direcionada
- QC suportado por sequenciação do genoma completo
- Análise de CNV/SNV/SV
- Revisão de grandes deleções ou inserções no alvo onde apropriado.
- Análise da junção de inserção do doador
- Resumo de classificação de clones ou resumo de seleção de clones
- Visualização personalizada pronta para figuras
- Registo de parâmetro de pipeline
Para uma avaliação mais ampla de off-target, consulte o nosso Descoberta de Alvos Indesejados do CRISPR e Validação de Alvos Indesejados do CRISPR páginas.
Um relatório sólido deve ajudar a sua equipa a comparar clones, não apenas a arquivar ficheiros de sequenciação. Resultados úteis podem incluir tabelas de resumo a nível de clone, gráficos de locais-alvo, evidências de junção doador, tabelas de candidatos fora do alvo, figuras de controlo de qualidade a nível genómico e notas de interpretação final.
Isto é especialmente útil quando a linha de iPSC editada apoiar a modelagem de doenças, descoberta de fármacos ou experimentos a longo prazo.
Cenários de aplicação para edição de iPSC e controlo de qualidade
Estes cenários de aplicação mostram como clones de iPSC editados podem apoiar a investigação subsequente quando o design de edição, a triagem de clones e o controlo de qualidade suportado por sequenciação são planeados em conjunto.
Geração de modelo de doença e controlo isogénico
Linhas de iPSC editadas são frequentemente utilizadas para modelar variantes associadas a doenças ou gerar controlos isogénicos. Nestes projetos, a validação do local-alvo, a comparação de clones e a QC genómica opcional podem ajudar a sua equipa a selecionar clones com melhor suporte antes da diferenciação ou ensaios funcionais.
Desenvolvimento de modelos para descoberta de fármacos
Os programas de descoberta de fármacos podem utilizar modelos derivados de iPSC editadas para estudar mecanismos de doença, resposta a vias ou efeitos de compostos. Um pacote de controlo de qualidade claro ajuda a reduzir a incerteza antes de a linha editada ser utilizada em triagens maiores ou no desenvolvimento de ensaios.
Genómica funcional e investigação de mecanismos
Modelos iPSC de knockout, knock-in, reporter e mutação pontual podem apoiar estudos de genómica funcional e mecanismos. Um plano de validação suportado por sequenciação ajuda a garantir que o fenótipo observado está o mais ligado possível à edição pretendida.
Apoio à investigação em medicina regenerativa
Para a investigação em medicina regenerativa, linhas de iPSC editadas podem necessitar de uma revisão mais profunda a nível de clone e do genoma antes do uso experimental posterior. Podemos ajudar a planear a profundidade do QC com base nos objetivos da investigação, mantendo a interpretação dentro do âmbito de um serviço de investigação.
Resultados da demonstração: o que um pacote de QC de iPSC editado pode incluir
Os resultados da demonstração ajudam a sua equipa a compreender como pode ser um pacote final de QC. Estes exemplos mostram formatos de saída comuns quando correspondem ao design do projeto.
Demonstração 1: Confirmação de edição no site-alvo
Uma saída de confirmação do local-alvo pode mostrar se a edição pretendida está presente. Dependendo do método, isso pode incluir traços de sequência, resumos de sequenciamento de amplicões, perfis de indels, evidências de junção do doador ou tabelas de edição a nível de alelo.
Isto ajuda a sua equipa a ir além de "editado ou não editado" e a rever o resultado exato ao nível da sequência.
Demonstração 2: Triagem de clones e comparação de genótipos
A comparação de clones é útil quando múltiplos clones candidatos estão disponíveis. Um relatório pode comparar o ID do clone, o genótipo, o estado do alelo, o padrão de edição, o estado de expansão, o suporte à inserção do doador e as bandeiras de controlo de qualidade.
Isto facilita a decisão sobre quais clones devem avançar para QC mais aprofundado ou ensaios subsequentes.
Demonstração 3: Resumo de QC genómico abrangente e revisão de off-target
Para projetos de iPSC editados de maior valor, podem ser adicionadas revisões de QC genómico ou de off-target. Um resumo pode incluir locais candidatos de off-target, descobertas de CNV/SNV/SV quando aplicável, notas de QC genómico e resumos prontos para figura.
O objetivo não é exagerar no que a QC pode provar. O objetivo é fornecer um pacote de evidências de pesquisa mais robusto para a revisão de clones.
FAQ: planeamento de um projeto de edição genética e controlo de qualidade de iPSC
1. Você pode trabalhar com a minha linha de iPSC existente?
Sim. Podemos rever a sua linha de iPSC existente, o objetivo da edição, as informações celulares disponíveis e as necessidades de QC antes da configuração do projeto. Informações úteis incluem a fonte celular, o histórico de passagens, o estado da cultura, o estado de micoplasma, se disponível, e o caso de uso posterior.
2. Que tipos de edição esta solução pode suportar?
Esta solução pode apoiar o planeamento de projetos de knockout, knock-in, mutação pontual, correção de mutações, inserção de repórteres e controlo isogénico. O fluxo de trabalho exato depende da sequência-alvo, do modelo doador, das condições da linha celular e dos objetivos de validação.
3. Preciso de rastreio monoclonal?
Se a sua equipa precisa de um clone iPSC editado estável para estudos subsequentes, a triagem monoclonal é geralmente importante. Permite que clones individuais sejam genotipados, comparados e selecionados com base em evidências ao nível do clone.
4. A sequenciação de Sanger é suficiente para a validação de iPSCs editadas?
A sequenciação de Sanger pode ser útil para a triagem inicial de locais-alvo, mas pode não ser suficiente para todos os projetos. A sequenciação de amplicões, sequenciação direcionada, validação fora do alvo ou QC suportado por WGS podem ser úteis quando é necessária uma resolução ao nível do alelo ou um contexto genómico mais amplo.
5. Quando deve ser adicionada a WGS ao QC de iPSC editadas?
O WGS pode ser considerado quando um clone apoiar estudos subsequentes de alto valor, modelagem de doenças isogénicas, diferenciação a longo prazo ou projetos onde o contexto genómico é importante. Não é necessário para cada clone editado.
6. Que informações sobre amostras ou projetos devo fornecer?
Informação útil inclui gene alvo, tipo de edição, fonte de iPSC, modelo doador, informações sobre o RNA guia, sequência alvo, lista de clones, dados de QC de gDNA disponíveis, entregáveis desejados e uso em investigação posterior.
7. Podes comparar múltiplos clones editados?
Sim. A comparação de clones pode incluir genótipo, estado do alelo, padrão de edição do local-alvo, suporte à junção do doador, bandeiras de QC, qualidade de sequenciamento e notas de relatório. Isso ajuda a sua equipa a decidir quais clones devem avançar.
8. Quais saídas de bioinformática podem ser incluídas?
As saídas podem incluir resumos de validação de locais-alvo, perfis de indels ou alelos, tabelas de comparação de clones, tabelas de validação de candidatos a off-target, revisão de CNV/SNV/SV quando aplicável, notas de QC em todo o genoma e resumos de relatórios finais.
9. Esta solução pode suportar modelagem de doenças ou projetos de controlo isogénico?
Sim. Linhas de iPSC editadas são frequentemente utilizadas em modelagem de doenças e investigação de controlo isogénico. Podemos ajudar a planear a estratégia de edição e controlo de qualidade para que as evidências a nível de clone apoiem a revisão da investigação subsequente.
10. Quais entregáveis podem ser incluídos?
Dependendo do âmbito do projeto, os entregáveis podem incluir informações de clones editados, dados de sequenciamento, resultados de validação de locais-alvo, tabelas de comparação de clones, saídas de bioinformática, resumos de controlo de qualidade e notas do relatório final.
Estudo de Caso: um controlo de qualidade mais aprofundado pode revelar defeitos ocultos em iPSCs editadas com CRISPR
Caso de literatura de acesso aberto
Diário: Relatórios de Células-Tronco
Publicado: 2022
DOI: 10.1016/j.stemcr.2022.02.008
Fundo
Este estudo de acesso aberto examinou uma preocupação chave de qualidade em projetos de iPSC editados por CRISPR. Linhas de iPSC humanas são amplamente utilizadas para modelagem de doenças e geração de controles isogénicos, mas clones editados podem apresentar alterações inesperadas no alvo que são difíceis de detectar apenas com PCR curto e sequenciação Sanger.
O estudo é relevante para esta solução porque mostra porque o controlo de qualidade de iPSC editadas pode precisar de mais do que uma simples verificação do local-alvo, especialmente quando os clones irão apoiar experimentos importantes a jusante.
Métodos
Os autores avaliaram 27 clones de iPSC gerados após edição CRISPR/Cas9 em 9 loci genómicos em 4 genes. Esses clones inicialmente pareciam estar corretamente editados com base em PCR curto e sequenciação Sanger.
Para uma análise mais aprofundada, o estudo utilizou ensaios de controlo de qualidade, incluindo PCR de genotipagem quantitativa do número de cópias de alelos e sequenciação de SNPs heterozigóticos próximos. O objetivo era identificar grandes eventos no alvo e padrões de perda de heterozigosidade que poderiam ser perdidos pela validação padrão.
Resultados
O estudo descobriu que 33% dos clones de iPSC editados apresentavam grandes defeitos genómicos no alvo, incluindo inserções e perda de heterozigose. Importante, todos esses defeitos escaparam à análise padrão de PCR e sequenciação Sanger. A publicação relata que 8 dos 27 clones mostraram um número de cópias alélicas mais baixo por qgPCR, e um clone adicional mostrou um padrão de perda de heterozigose neutra em cópias através da análise de SNPs próximos.
Figura 2 apresenta a avaliação do número de cópias de alelos em clones de iPSC editados. Inclui o conceito do ensaio qgPCR, resultados do número de cópias de alelos em 27 clones, análise de SNPs próximos e um gráfico em forma de donut que resume os clones corretamente editados em comparação com os clones com edição monoalélica indesejada.
A Figura 2 do estudo de acesso aberto mostra como a avaliação do número de cópias de alelos pode revelar clones de iPSC editados com defeitos ocultos no alvo que escaparam à triagem padrão.
Conclusão
Este estudo apoia uma lição prática para projetos de iPSC editados: um clone que parece correto através da triagem padrão de locais-alvo pode ainda exigir um controlo de qualidade mais aprofundado, dependendo do objetivo da pesquisa.
Para um projeto de serviço, isso significa que o plano de QC deve ser definido cedo. A validação do local-alvo, a comparação de clones, a revisão de off-target e o QC genômico devem ser selecionados com base em como o clone editado será utilizado.
Referência
