Diretrizes para Submissão de Amostras
Transformar questões de integração CAR/vector em evidência pronta para sequenciamento.
Os estudos de CAR-T in vivo e de engenharia de células imunes in vivo frequentemente levantam questões que um arquivo de sequenciamento básico não consegue responder por si só. A sua equipa pode precisar de saber se as sequências relacionadas com CAR/vetor estão integradas, onde estão localizados os locais de integração candidatos, se certos locais estão enriquecidos e como o perfil de integração muda entre amostras.
A nossa solução de análise de locais de integração CAR-T in vivo ajuda-o a passar de resultados de sequenciação bruta para um perfil de integração mais claro. O objetivo não é apenas detectar locais, mas organizá-los em coordenadas genómicas, tabelas de anotação, resumos de abundância de clones, notas de controlo de qualidade e figuras prontas para revisão.
O que esta solução o ajuda a responder.
- As sequências relacionadas a CAR/vetores estão integradas no genoma do hospedeiro?
- Onde estão localizados os locais de integração de candidatos?
- Quais genes ou características genómicas próximas estão associados a esses locais?
- Alguns sites de integração são suportados por contagens de leitura ou fragmentos mais elevados?
- Os perfis de integração diferem entre tecidos, momentos temporais ou grupos?
- Quais são os resultados de QC e bioinformática necessários para a revisão interna do projeto?
Para muitos projetos, o resultado mais útil não é apenas uma lista de sites. É um perfil de integração estruturado que liga a evidência de sequência ao contexto genómico.
Por que uma lista de sites de integração não é suficiente
Uma tabela básica de integração pode mostrar coordenadas genómicas, mas isso nem sempre indica à sua equipa como rever o resultado. Um relatório útil frequentemente necessita de anotação de genes próximos, distribuição cromossómica, categorias de características genómicas, abundância de clones, QC a nível de amostra e comparação entre amostras.
Ajudamo-lo a planear esses resultados antes de começar a sequenciação. Isso torna os resultados finais mais fáceis de rever e reduz o risco de gerar dados que são tecnicamente válidos, mas difíceis de interpretar.
As nossas capacidades de serviço para estudos de integração CAR-T in vivo.
Apoiamo projetos de integração de sítios CAR-T in vivo como estudos integrados de sequenciação e bioinformática, e não como tarefas isoladas de geração de dados. Antes do início do projeto, a nossa equipa pode rever o seu design de CAR/vetor, a fonte da amostra, o estado do ADN genómico, a biologia de integração esperada e os objetivos de relatório.
Essa revisão inicial é importante. A melhor estratégia para uma amostra de células engenheiradas purificadas pode não ser a mesma que a estratégia para células derivadas de tecido, células imunes classificadas ou DNA genómico de baixo input de um estudo in vivo.
Contextos de construção de Vector e CAR que podemos suportar.
- Pesquisa de engenharia CAR in vivo
- Pesquisa sobre CAR-T ou células imunes engenheiradas
- Perfilagem de integração de vetores lentivirais ou retrovirais
- Análise de junção vetor-hospedeiro
- Suporte de sequenciação relacionado à construção CAR/vector
- Comparação de perfis de integração de múltiplas amostras
Módulos de sequenciação e anotação do site de integração
- Revisão da informação da sequência CAR/vector
- Revisão de QC e viabilidade do DNA genómico
- Estratégia de enriquecimento de junção de integração ou biblioteca direcionada
- Deteção de locais de integração baseada em NGS
- Chamada de sites candidatos e atribuição de coordenadas genómicas
- Anotação de genes e características genómicas nas proximidades
- Resumo da abundância de clones ou suporte de local onde suportado
- Comparação entre amostras cruzadas
- Visualização pronta para relatório e notas de bioinformática
Apoio à execução do projeto desde a revisão de amostras até a entrega do relatório.
Um projeto sólido começa com a informação correta. Antes da sequenciação, ajudamo-lo a rever a sequência do CAR/vetor ou a informação do LTR, tipo de amostra e formato de recolha, quantidade e concentração de ADN genómico, agrupamento de amostras e pontos de tempo, sinal de integração esperado, disponibilidade de amostras de controlo, categorias de anotação desejadas e tabelas e figuras de saída necessárias.
Isto ajuda a sua equipa a alinhar a questão experimental com o design do ensaio e o plano de bioinformática.
Escolha a estratégia certa de deteção do local de integração.
Não há um único método de integração que se adapte a todos os projetos de CAR-T in vivo. A escolha do método depende da biologia do vetor, da qualidade da amostra, da entrada de DNA, das informações sobre a sequência-alvo e se a sua equipa precisa de sensibilidade, contexto genómico, abundância de clones ou detalhes estruturais.
| Método | Pergunta de melhor ajuste | Necessidade de Entrada | Força | Limitação | Uso Sugerido |
|---|---|---|---|---|---|
| LAM-PCR | Onde estão as junções de hospedeiros vetoriais? | Sequência LTR/vector conhecida; DNA genómico | Enriquece as junções de integração a partir de extremidades de vetores conhecidos. | Pode introduzir viés de amplificação. | Vetores de integração conhecidos com design de junção definido |
| nrLAM-PCR | A deteção de junções pode ser melhorada com a redução do viés de restrição? | Sequência de vetor conhecida; DNA genómico | Útil para recuperar junções com menos dependência de locais de restrição. | Ainda dependente da amplificação | Descoberta de locais de integração quando é necessário o enriquecimento de junções. |
| Captura Direcionada NGS | Podem as regiões conhecidas de CAR/vetores ser capturadas e mapeadas? | sequência CAR/vector; DNA genómico | Designação de alvo flexível e suporte de sequência útil | Depende do design da sonda ou do alvo. | Confirmação de CAR/vetor mais evidência de junção |
| Sequenciação do Genoma Completo | É necessário um contexto genómico mais amplo? | DNA genómico de maior qualidade | Informação contextual a nível genómico e informações mais amplas a nível de variantes | Menor sensibilidade para eventos de integração raros | Amostras selecionadas com DNA adequado e questões genómicas mais amplas |
| Sequenciação de Longa Leitura | A estrutura de longo alcance ou o contexto de inserção complexa são importantes? | DNA de alta qualidade | Pode suportar um contexto estrutural de maior alcance. | Requisitos mais elevados de qualidade de entrada e de ADN | Questões complexas de inserção ou relacionadas com a estrutura |
| Estratégia Híbrida | Precisamos de sensibilidade e contexto genómico? | Específico do caso | Combina evidência direcionada e mais ampla. | Design e interpretação mais complexos | Projetos de integração de múltiplas leituras |
Para serviços relacionados da CD Genomics, consulte o nosso Sequenciação de Locais de Integração Lentiviral/Retroviral, Análise do Local de Integração para Integração de Transgenes, Sequenciação de Região Alvo, e Sequenciação do Genoma Completo páginas.
Comece com a biologia do vetor e a informação sobre a construção do CAR. Se o seu objetivo principal é a deteção de junções vetor-hospedeiro, uma estratégia de enriquecimento de junções pode ser apropriada. Se a sua equipa também precisa de verificar as regiões do CAR/vetor, o sequenciamento direcionado pode ser adicionado. Se a questão envolver um contexto genómico mais amplo, o sequenciamento de genoma completo ou de leituras longas pode ser considerado para amostras selecionadas.
A análise da abundância de clones deve ser planeada apenas quando o desenho da amostra e a estratégia de sequenciação suportam uma comparação significativa. As categorias de anotação também devem ser escolhidas antes do início da sequenciação, para que o resultado final possa incluir genes próximos, características genómicas, distribuição cromossómica e resumos a nível de amostra.
Fluxo de amostra para relatório com pontos de controlo de QC
O nosso fluxo de trabalho conecta o ensaio técnico com o processo de serviço. Uma vez que as amostras entram no projeto, continuamos a verificar se cada etapa ainda suporta a questão de investigação original.
Passo 1: Receção do projeto e revisão das informações do vetor
Começamos por rever a construção ou sequência do vetor CAR, informações sobre o LTR/fim do vetor quando disponíveis, sistema de vetor e biologia de integração esperada, tipo e fonte da amostra, grupos de tecido, célula ou ponto temporal, quantidade e qualidade do ADN genómico, e saídas desejadas e grupos de comparação.
Este passo ajuda-nos a decidir se o projeto deve concentrar-se no enriquecimento de junções, sequenciação direcionada, análise genómica mais ampla ou um design híbrido.
Passo 2: Amostra de recibo, verificação de identidade e QC de gDNA
Após a receção da amostra, verificamos a identidade da amostra, a rotulagem e as informações de QC disponíveis. Para o DNA genómico extraído, analisamos a quantidade, concentração, pureza, degradação e compatibilidade com a estratégia selecionada.
Se as amostras forem submetidas como PBMC, células imunes classificadas, células derivadas de tecido, pellets celulares ou material de baixo input, pode ser necessária uma revisão de viabilidade antes que o plano final do ensaio seja confirmado.
Passo 3: Enriquecimento de junção de integração ou estratégia de biblioteca
O fluxo de trabalho técnico depende do método escolhido. Para estratégias de enriquecimento de junções, as junções vetor-hospedeiro são seletivamente enriquecidas a partir do DNA genómico. Para abordagens de captura direcionada, regiões relacionadas com CAR/vetor podem ser capturadas e sequenciadas. Para abordagens de genoma completo ou leituras longas, a preparação da biblioteca é projetada em torno de um contexto genómico mais amplo ou informações estruturais.
O objetivo é gerar dados que possam suportar a chamada de locais de integração, não apenas a saída de sequenciação geral.
Passo 4: Processamento de sequenciamento e leitura de junção
Os dados de sequenciação são processados para identificar leituras ou fragmentos que suportam junções vetor-hospedeiro. Isso pode incluir filtragem de leituras, alinhamento, aparo de sequências derivadas do vetor, mapeamento para um genoma de referência, revisão de duplicados e remoção de artefatos prováveis, dependendo do método.
Os pontos de controlo de QC podem incluir rendimento de leitura, qualidade de mapeamento, suporte de leitura de junção, consistência a nível de amostra e o número de locais de integração candidatos detetados.
Passo 5: Chamada do site de integração, anotação e entrega do relatório
Os locais de integração dos candidatos estão organizados em um pacote de saída estruturado. Dependendo do projeto, o relatório pode incluir coordenadas genómicas, contagens de leituras ou fragmentos de suporte, anotação de genes próximos, distribuição de características genómicas, distribuição cromossómica, resumos de abundância de clones e comparação entre amostras.
O entregável final foi criado para ajudar a sua equipa a rever os perfis de integração e decidir se são necessários mais experimentos.
Requisitos amostrais para projetos de integração de CAR/vetor.
As necessidades de amostras dependem do método, tipo de vetor, nível de integração esperado e qualidade do DNA. A tabela abaixo fornece pontos de partida práticos. Os requisitos exatos devem ser confirmados durante a revisão do projeto.
| Tipo de Amostra | Entrada Recomendada | Concentração | Contentor | Envio | Pontos de Verificação de QC | Notas |
|---|---|---|---|---|---|---|
| DNA genómico extraído | ≥100 ng | ≥10 ng/μl | tubo livre de DNase | Pacotes de gelo ou gelo seco | OD260/OD280 1.8-2.0, purificado, não degradado | Fornecer sequência CAR/vetor ou informações LTR |
| PBMC / células imunes selecionadas | Específico do projeto; extração de gDNA necessária | A definir após a extração | Cryotubo ou tubo aprovado | gelo seco | Identidade celular, estado viável/congelado, rendimento de DNA | Fornecer tipo de célula-alvo e método de enriquecimento. |
| Células derivadas de tecido | Específico do projeto; revisão de viabilidade recomendada | A determinar após a extração | Cryotubo | gelo seco | Origem do tecido, fração celular, qualidade do DNA | Útil para amostras relacionadas à distribuição in vivo |
| Pellets celulares / células engenheiradas cultivadas | Específico do projeto; células suficientes para extração de gDNA | A definir após extração | Cryotubo ou tubo aprovado | Gelo seco | Contagem celular, identidade da amostra, rendimento da extração | Útil para estudos de células imunes engenheiradas |
| DNA genómico de baixo input | Revisão de viabilidade necessária | Caso a caso | Tubo de baixa ligação | Pacotes de gelo ou gelo seco | Concentração, degradação, nível de integração esperado | Pode exigir uma biblioteca adaptada ou uma estratégia de amplificação. |
Antes da submissão, é útil partilhar o mapa CAR/vector, a sequência LTR ou a sequência de extremidade do vetor, os grupos de amostras, o tipo celular alvo, o estado de integração esperado e quaisquer dados de QC de DNA existentes.
Análise bioinformática e entregáveis
A bioinformática é central para esta solução. A questão chave não é apenas se os locais de integração podem ser detectados, mas se os resultados podem ser revistos, filtrados, anotados e comparados de uma forma útil.
Entregas mínimas
- Dados de sequenciação brutos e dados limpos, quando aplicável.
- Resumo de QC de sequenciação a nível de amostra
- Resumo do suporte de leitura de junction-read ou vector-host
- Tabela de integração de candidatos
- Anotação de coordenadas genómicas
- Anotação de genes nas proximidades
- Distribuição de características genómicas
- Visualização da distribuição cromossómica
- Resumo da abundância de clones ou suporte ao local onde for suportado.
- Notas do relatório de análise
Para suporte de análise personalizada, consulte o nosso Bioinformática serviços.
Adicionais opcionais
- Comparação de perfis de integração de amostras cruzadas
- Análise do perfil de integração multi-tecido ou multi-ponto temporal
- Visualização de clone dominante ou site enriquecido
- Anotação de proximidade de categorias de genes onde apropriado para revisão de pesquisa
- Região repetida, TSS, ilha CpG ou anotação promotora proximal
- Análise de contexto estrutural de leitura longa
- Visualização personalizada pronta para figuras
- Registro de parâmetro de pipeline
Um projeto bem planeado pode fornecer tanto ficheiros de dados como visuais de resumo. Estes podem incluir tabelas de locais de integração, ficheiros de anotação, gráficos cromossómicos, gráficos de distribuição de características, resumos de abundância de clones e notas de relatório.
Para acompanhamento a nível de expressão, o nosso Sequenciação de RNA o serviço pode ser considerado. Para questões de integração específicas de vetor, o nosso Análise do Local de Integração do AAV a página também pode ser útil como uma referência relacionada.
Cenários de aplicação para pesquisa de CAR-T in vivo e integração de vetores
Estes cenários de estudo mostram como a análise do local de integração pode apoiar a pesquisa de CAR/vetores quando é necessário o contexto genómico, o perfil clonal ou a comparação entre amostras.
Estudos de engenharia CAR in vivo
Estudos de engenharia CAR in vivo podem exigir evidências de que sequências relacionadas a CAR/vetor estão integradas e podem ser analisadas no contexto genómico. A análise de locais de integração pode ajudar a sua equipa a examinar locais de inserção candidatos, padrões de anotação e diferenças a nível de amostra.
Perfilagem de integração de vetores CAR lentivirais ou retrovirais
Os vetores lentivirais e retrovirais são contextos comuns para a análise de locais de integração. Nestes estudos, a deteção de junções vetor-hospedeiro, a abundância de clones e a anotação de características genómicas podem ser resultados importantes.
Comparação de perfis de integração multi-tecidual ou longitudinal
Para estudos in vivo com múltiplos tecidos ou pontos temporais, os perfis de integração podem ser comparados entre amostras quando o desenho do estudo o suporta. Isso pode ajudar a sua equipa a rever se os padrões de integração candidatos diferem entre fontes de tecido, tempos de coleta ou grupos experimentais.
Pesquisa de células imunes engenheiradas e confirmação de construção
Alguns estudos podem necessitar de suporte de sequência relacionado ao constructo e mapeamento do local de integração. Nesses casos, a sequenciação direcionada, a revisão da sequência do vetor e a análise do local de integração podem ser combinadas em um pacote de evidências mais abrangente.
Referências
- A análise baseada em tagmentação revela o comportamento clonal das células CAR-T em associação com os locais de integração do lentivetor.
- Perfilagem conjunta da acessibilidade da cromatina e análise do local de integração de CAR-T a níveis populacionais e de célula única
- IS-Seq: um pipeline de bioinformática para análise de locais de integração com métodos abrangentes de quantificação de abundância
- VISA - Servidor de Análise de Sites de Integração Vetorial: um servidor baseado na web para identificar rapidamente sites de integração retroviral a partir de sequenciação de nova geração.
- Ub-ISAP: um pipeline UNIX simplificado para extrair locais de integração de vetores virais únicos a partir de dados de sequenciação de nova geração
Resultados da demonstração: o que o seu perfil de integração pode incluir.
Os resultados da demonstração ajudam a sua equipa a entender como os dados do site de integração podem ser organizados. Os exemplos abaixo mostram formatos de resultados comuns que podem ser incluídos quando correspondem ao desenho do estudo.
Demonstração 1: Distribuição cromossómica dos locais de integração
Uma vista de distribuição cromossómica pode mostrar como os locais de integração candidatos estão distribuídos entre cromossomas e amostras. Isto pode ajudar a sua equipa a rever se os locais aparecem amplamente distribuídos ou concentrados em regiões selecionadas. Uma saída típica pode incluir ID do cromossoma, coordenada genómica, ID da amostra, contagem de leituras ou fragmentos de suporte, e visualização por cromossoma.
Demonstração 2: Anotação de genes e características genómicas nas proximidades
Uma tabela de anotação genética pode mostrar quais genes ou características genómicas estão próximas dos locais de integração candidatos. Dependendo das categorias de anotação selecionadas, o relatório pode incluir rótulos de corpo do gene, intrónico, intergénico, próximo do promotor, associado a repetições, unidade de transcrição ou outros rótulos de características. Esta saída ajuda a transformar coordenadas em um contexto genómico mais útil.
Demonstração 3: Comparação de abundância de clones e amostras
Quando suportados pelo design do ensaio, a abundância de clones ou resumos de suporte a locais podem ajudar a comparar perfis de integração entre amostras. Por exemplo, um relatório pode mostrar padrões clonais candidatos entre tecidos, pontos temporais ou grupos de tratamento. Uma visualização típica pode incluir um mapa de calor, um gráfico de barras empilhadas ou uma tabela de suporte a locais ordenada.
FAQ: planeamento de um projeto de integração de sítio CAR-T in vivo
1. Preciso de análise do local de integração para cada estudo in vivo de CAR-T?
Nem sempre. A análise do local de integração é mais útil quando o sistema vetor pode integrar, quando a localização do local de inserção é importante, ou quando a sua equipa precisa de informações sobre o perfil clonal. Se a questão principal for a presença do vetor, expressão ou biodistribuição, outro tipo de leitura pode ser mais apropriado ou pode precisar de ser combinado com a análise do local de integração.
2. Qual o tipo de amostra mais adequado para a deteção do local de integração do CAR/vetor?
O DNA genómico extraído é geralmente a entrada mais direta. PBMC, células imunes classificadas, células derivadas de tecidos, pellets celulares ou células engenheiradas cultivadas também podem ser adequadas se for possível obter uma quantidade suficiente de DNA genómico de qualidade aceitável.
3. Pode ser utilizado DNA de baixo input?
O DNA de baixo input pode ser possível, mas requer uma revisão de viabilidade. O nível de integração esperado, a qualidade do DNA, as informações da sequência do vetor e o método selecionado afetam todos se o projeto pode avançar.
4. Que informações sobre o vetor ou a construção CAR devo fornecer?
Informação útil inclui o mapa CAR/vector, sequência LTR ou sequência de extremidade do vetor, região do transgene, mecanismo de integração esperado, grupos de amostras e quaisquer sequências-alvo conhecidas para o design de ensaios.
5. Qual é a diferença entre a confirmação da sequência do vetor e o mapeamento do local de integração?
A confirmação da sequência do vetor verifica se as regiões esperadas de CAR/vetor são suportadas pela sequenciação. O mapeamento do local de integração procura junções vetor-anfitrião e atribui locais de inserção candidatos a coordenadas genómicas. Alguns projetos precisam de ambos.
6. Pode a abundância de clones ser estimada a partir de dados do local de integração?
Resumos de abundância de clones ou de suporte a locais podem ser incluídos quando o design do ensaio e os dados de sequenciação o suportarem. O resultado deve ser interpretado como um perfil de investigação, não como uma conclusão independente.
7. Podem os perfis de integração ser comparados entre tecidos ou pontos temporais?
Sim, se o desenho do estudo incluir amostras comparáveis e qualidade de dados suficiente. A comparação entre amostras pode mostrar diferenças nos padrões de integração de candidatos, suporte do local ou perfil clonal entre tecidos, pontos temporais ou grupos.
8. Quais saídas de bioinformática podem ser incluídas?
As saídas podem incluir tabelas de locais de integração de candidatos, coordenadas genómicas, anotação de genes próximos, distribuição de características genómicas, gráficos de distribuição cromossómica, resumos de abundância de clones, resumos de QC a nível de amostra e notas de relatório.
9. Esta solução pode suportar estudos de vetores lentivirais e retrovirais?
Sim. Estudos com vetores lentivirais e retrovirais são contextos comuns para a análise de locais de integração, pois a deteção de junções vetor-hospedeiro e a revisão do perfil clonal podem ser importantes para a interpretação da pesquisa.
A CD Genomics pode ajudar a decidir qual método é apropriado?
Sim. Podemos rever o seu tipo de vetor, a construção do CAR, a amostra de origem, a quantidade de ADN, o perfil de integração esperado e os objetivos de relatório para ajudar a selecionar uma estratégia adequada.
Estudo de Caso: Comportamento clonal da CAR-T revelado pela análise do local de integração
Caso de literatura de acesso aberto
Diário: Terapia Molecular - Oncolíticos
Publicado: 2023
DOI: 10.1016/j.omto.2023.05.004
Fundo
Este estudo de acesso aberto focou na análise de locais de integração em células CAR-T engenheiradas com lentivectores. Os autores desenvolveram o DIStinct-seq, um método baseado em tagmentação para detectar locais de integração e analisar o comportamento clonal a partir de dados de sequenciação.
O estudo é relevante para esta solução porque demonstra como a análise do local de integração pode fornecer mais do que uma lista de coordenadas de inserção. Quando os dados são relacionados com o tamanho do clone, medidas de diversidade, anotação genómica e comparação de pontos temporais, podem ajudar os investigadores a rever como as populações de células CAR-T mudam após a infusão num modelo in vivo.
Métodos
Os autores utilizaram um transposoma Tn5 ligado a esferas para preparar bibliotecas para análise de locais de integração. Primeiro validaram o DIStinct-seq utilizando clones com locais de integração conhecidos, e depois aplicaram o método a produtos CAR-T ex vivo e a células CAR-T recolhidas de ratos após a infusão.
O fluxo de trabalho de bioinformática focou em leituras contendo sequências de repetições terminais longas, aparo de porções de sequências derivadas de vetores, mapeamento para um genoma de referência de fusão humano/vetor, filtragem de artefatos e identificação de locais de junção entre o genoma humano e o vetor. O estudo também utilizou medidas de abundância clonal com base em contagens de fragmentos brutos e contagens de fragmentos deduplicados.
Resultados
O estudo detetou um total de 17.695 locais de integração de três produtos CAR-T utilizando 500 ng de ADN por amostra. Para as amostras in vivo, os autores analisaram células CAR-T recolhidas no dia 30 e no dia 60 após a infusão. Detetaram entre 4.055 e 4.473 locais de integração para os produtos CAR-T, entre 2.650 e 6.233 locais de integração no dia 30, e entre 1.034 e 4.895 locais de integração no dia 60.
Figura 4 mostra como as células CAR-T se expandiram policlonalmente com diversidade reduzida in vivo, e como a persistência estava associada à integração em abrigos genómicos seguros. A figura inclui o desenho do estudo em ratos, a tendência de qPCR específica do vetor, o índice de entropia de Shannon, a proporção do clone dominante e a distribuição de abrigos genómicos seguros entre os grupos de clones.
Os autores observaram que os produtos CAR-T apresentavam uma maior diversidade clonal do que as amostras in vivo. As amostras in vivo mostraram uma diminuição da diversidade do dia 30 ao dia 60. Também relataram que a proporção de clones no 1% superior por tamanho era menor no produto CAR-T e maior nas amostras in vivo no dia 30 e no dia 60.
A Figura 4 do estudo de acesso aberto mostra como a análise do local de integração pode conectar o comportamento clonal, a comparação de pontos temporais e a revisão do contexto genómico na investigação de CAR-T.
Conclusão
Este estudo apoia um ponto chave para projetos de locais de integração de CAR-T in vivo: os dados dos locais de integração tornam-se mais úteis quando estão ligados ao comportamento clonal, anotação genómica e comparação entre amostras.
Para um projeto de serviço, a lição prática é clara. Um plano de análise do local de integração útil deve definir os grupos de amostra, a estratégia de junção de integração, a abordagem de abundância de clones, as categorias de anotação e os resultados de relatório antes do início do sequenciamento.
Referência
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