Sequenciação de Metilação de DNA de Célula Única

A CD Genomics oferece análise de metilação de DNA em células individuais para compreender a heterogeneidade dos padrões de 5-metilcitosina (5mC) em todo o genoma.

A Introdução da Sequenciação de Metilação de DNA em Células Únicas

A metilação do DNA é reconhecida como um dos principais contribuintes para o desenvolvimento normal e a regulação da expressão génica. É essencial para a manutenção da identidade celular e está associada a vários processos-chave, incluindo a impressão genética, a inativação do cromossoma X, a repressão de elementos transponíveis, o envelhecimento e a carcinogénese. O método atual para investigar a metilação do DNA é apenas através de uma abordagem em massa, como sequenciação de bisulfito de genoma completo (WGBS), sequenciação de bisulfito com representação reduzida (RRBS)e Sequenciação MeDIP. Combinamos a preparação de bibliotecas de WGBS de célula única altamente inovadora e a Illumina. sequenciação de próxima geração tecnologia para visualizar estados de metilação genómica com resolução de célula única. O sequenciamento de bisulfito de todo o genoma em célula única permite a descoberta de heterogeneidade celular que normalmente é mascarada pelo sequenciamento de metilação em massa padrão. Fornecemos um fluxo de trabalho simplificado para a realização de WGBS bibliotecas. O DNA de entrada é fragmentado aleatoriamente durante a etapa inicial de tratamento com bisulfito, seguida pela preparação da biblioteca WGBS. O procedimento pode acomodar entradas de DNA ultra-baixas, tornando-o ideal para a análise de metilação de amostras preciosas, limitadas e enriquecidas por alvo.

Quais são as Vantagens da Sequenciação de Metilação de DNA a Nível de Célula Única

• Perfilagem de metilação a nível de célula única com alta resolução: Esta abordagem metodológica permite a aquisição de paisagens de metilação intricadas a nível de célula única. Serve como um catalisador para investigar a heterogeneidade celular e as alterações dinâmicas, impulsionando assim a nossa compreensão da diversidade celular e das transições de estado.
• Revelando transições de estado celular e trajetórias evolutivas: Através do acompanhamento meticuloso da dinâmica de metilação em células individuais, esta metodologia revela a intrincada coreografia das transições de estado celular e das trajetórias de desenvolvimento. Tais revelações oferecem vislumbres inestimáveis sobre os fundamentos moleculares do desenvolvimento e da evolução celular.
• Desenterrar disparidades funcionais entre células individuais: Através de uma análise comparativa meticulosa dos perfis de metilação, este método ilumina disparidades funcionais entre células individuais, elucidando assim potenciais mecanismos que governam a função celular e a regulação epigenética.
• Requisito mínimo de entrada de DNA: Caracterizada pela sua exigência mínima de entrada de DNA, esta técnica facilita a obtenção de limiares de deteção ultra-baixos com apenas um número reduzido de células.
• Análise bioinformática: Os dados obtidos abrem caminho para uma análise exaustiva e intricada. análises bioinformáticas, fornecendo um conteúdo informativo rico para uma análise meticulosa.
• Avaliação da qualidade dos dados: Parâmetros como a taxa de mapeamento e a redundância refletem de perto os dos convencionais. WGBS dados, garantindo assim a integridade e a fiabilidade dos dados obtidos.

Quais são as aplicações da sequenciação de metilação de DNA em células únicas?

No âmbito da investigação científica, as investigações sobre padrões de metilação em células únicas e amostras raras e minúsculas são predominantemente aplicadas em vários domínios de pesquisa, como a elucidação da etiologia tumoral, estudos sobre o câncer, diagnósticos de embriões pré-implantação, desenvolvimento embrionário inicial, recombinação de células germinativas, investigação de células estaminais e exploração da heterogeneidade celular. Estes esforços frequentemente envolvem amostras que incluem células únicas, populações celulares minúsculas e quantidades traço de ADN. Esta metodologia é particularmente adequada para analisar espécimes elusivos que são difíceis de obter e amostras de tecido que exibem uma heterogeneidade celular significativa.

• Heterogeneidade tumoral: Revelando a paisagem de metilação das células cancerígenas.
• Diferenciação celular: Mapeamento de reguladores epigenéticos da diferenciação celular.
• Microambiente imune: Elucidação dos mecanismos regulatórios epigenéticos subjacentes à ativação, diferenciação e outros processos das células imunes.
• Neurociência: Classificação de subtipos de células neuronais e exploração dos mecanismos moleculares subjacentes a distúrbios relacionados com o neuro.

Fluxo de Trabalho de Sequenciação de Metilação de DNA de Célula Única

Com a preparação de bibliotecas pós-bisulfito para WGBS, o fluxo de trabalho pode ser concluído em poucas horas. O fluxo de trabalho geral para sequenciação de metilação de células únicas está descrito abaixo.

Especificação de Serviço

	Requisitos de Amostra Recomenda-se o uso de placas de 96 poços com suspensão de células vivas para este procedimento. Células congeladas em lisados especificamente congelados também podem ser utilizadas como material de partida. ScWGBS Tipo de Amostra: Linhas celulares, células primárias, tecido fresco, células congeladas; Quantidade e Qualidade Recomendada: Utilizar tubos de PCR de 200µl para armazenar células (células únicas ou múltiplas), 5µl de lisado por tubo, e não mais de 1µl de tampão ao coletar células. ≥3 réplicas biológicas. Tipo de Amostra ScRRBS: Linhagens celulares, células primárias, tecido fresco, células congeladas; Quantidade e Qualidade Recomendada: Utilizar tubos de PCR de 200µl para armazenar células (células únicas ou múltiplas), 5µl de lisado por tubo, e não mais de 1µl de tampão ao coletar células. ≥3 réplicas biológicas. >100 pg de DNA extraído deve estar livre de inibidores enzimáticos e pode ser suspenso em água, TE ou um tampão de baixa salinidade.
	Sequenciação Opções de serviço flexíveis incluem HiSeq X
	Análise de Bioinformática Alinhamento contra um genoma de referência Análise da profundidade e cobertura da sequência mC a chamar Análise do nível de metilação Tendências globais do metiloma Análise da densidade de metilação Análise de Regiões Methyladas Diferencialmente (DMRs) Anotação DMR e análise de enriquecimento (GO/KEGG) Análise de agrupamento

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes na Sequenciação de Metilação de DNA em Células Únicas para a sua escrita (personalização)

A conferência de Sequenciação de Células Únicas da CD Genomics foca nas ligações entre a variação celular nos tecidos e a função dos órgãos, além de elucidar as origens das doenças. Se tiver requisitos adicionais ou perguntas, não hesite em contactar-nos.

Referência:

1. Gravina, S et al. Sequenciação de bisulfito em todo o genoma a nível de célula única revela uma extensa heterogeneidade no metiloma do fígado de rato. Biologia do Genoma, 2016 17(1):150.

1. Quais são as vantagens do sequenciamento de metilação de DNA a partir de células únicas?

A utilização de sequenciação de metilação de DNA a partir de células únicas confere múltiplas vantagens. Primordialmente, proporciona os meios para escrutinar a heterogeneidade observada entre células individuais, rastrear populações celulares raras e monitorizar de perto as alterações dinâmicas na metilação do DNA durante fases de desenvolvimento ou progressão de doenças. Isto elucida impressões digitais epigenéticas específicas de células e facilita o escrutínio da regulação epigenética a nível celular individual.

2. Quais são os desafios associados ao sequenciamento de metilação de DNA em células individuais?

Apesar de uma infinidade de benefícios, a prática de sequenciação de metilação de DNA a partir de células individuais não está isenta de desafios. Predominantemente, envolve nuances técnicas complexas, como a isolação e amplificação de células individuais, que, juntamente com o peso financeiro e a complexidade da sequenciação de células singulares, representam obstáculos substanciais. Além disso, desafios consideráveis são encontrados durante a análise de dados, dada a escassez de células individuais. epigenómico dados e a subsequente necessidade de aparelhos de bioinformática personalizados.

3. Como é que o sequenciamento de metilação de DNA a partir de células únicas está a avançar a nossa compreensão da biologia e da doença?

A sequenciação de metilação de DNA a nível de célula única está a revolucionar a nossa compreensão das variações entre células individuais, os seus papéis nos processos de desenvolvimento biológico e os mecanismos por trás das doenças. Ao trazer à luz as nuances epigenéticas dentro de células individuais, a técnica está a desmistificar as complexidades da determinação do destino celular, regeneração de tecidos e a trajetória das doenças. Possui um grande potencial para revelar novos objetivos terapêuticos, aumentando assim o diagnóstico e tratamento de uma variedade de doenças, incluindo malignidades e distúrbios neurológicos.

4. Quais são as diferenças entre os métodos de célula única baseados em RRBS e os métodos de célula única baseados em WGBS?

Cobertura:

RRBSO RRBS é especificamente projetado para examinar regiões de ilhas CpG dentro do genoma através de um mecanismo conhecido como digestão por enzimas de restrição. Embora a sua abrangência genómica seja limitada, oferece uma cobertura de profundidade notável devido a este direcionamento específico.

WGBS: Ao contrário do RRBS, o WGBS analisa o terreno de metilação do genoma completo, que abrange ilhas de CpG, bem como regiões de cromatina caracterizadas por metilação fraca. Apesar de oferecer uma cobertura genómica mais ampla, a profundidade da cobertura é frequentemente comprometida.

Profundidade e Resolução:

RRBSPredominantemente, devido ao seu enriquecimento especializado em regiões de ilhas CpG, o RRBS frequentemente proporciona uma cobertura de profundidade robusta, embora a resolução seja mitigada, o que prejudica a capacidade de discernir regiões não-CpG presentes no genoma.

WGBS: Alternativamente, considerando que o WGBS abrange o genoma completo, a sua profundidade pode ser potencialmente prejudicada, especialmente em contextos de sequenciação de células únicas, quando comparado com o RRBS. No entanto, a superior resolução oferecida pelo WGBS facilita a captura de padrões de metilação genómica mais amplos.

Volume de Dados e Complexidade Analítica:

RRBS: Dada a sua gama de alvos restrita, o volume de dados gerado por RRBS é relativamente compacto, o que simplifica o processamento de dados subsequente.

WGBS: Em contraste, WGBS tipicamente resulta em um volume de dados tremendo, o que torna necessária uma capacidade de armazenamento e computação aumentada. Consequentemente, isso muitas vezes culmina em procedimentos de manuseio e interoperação de dados mais complexos.

Aplicações:

RRBS: No que diz respeito à investigação da metilação dentro de domínios de ilhas CpG, RRBS brilha como uma escolha ideal. É particularmente proficiente em investigar incidentes de metilação que são vitais para a funcionalidade do genoma e a sua regulação epigenética.

WGBS: Por outro lado, WGBS apresenta-se como uma escolha superior para a realização de uma elucidação abrangente dos padrões de metilação em todo o genoma. É instrumental na revelação de contornos de metilação globais e ajuda no estudo de eventos de metilação que são específicos de tipos celulares e aqueles propensos a mudanças dinâmicas.

Sequenciação do metiloma de DNA de células únicas de embriões humanos pré-implantação

Revista: Nature Genetics
Fator de impacto: 27,125
Publicado: 18 de dezembro de 2017

Fundo

Nos genomas mamíferos, a citosina, principalmente nos dinucleotídeos CpG, sofre metilação sob a catálise das DNA metiltransferases. Pesquisas revelaram que a metilação do DNA é crucial para numerosos processos biológicos, incluindo a repressão da expressão génica, a regulação da atividade transcricional de transposões, a inativação do cromossoma X e a manutenção da impressão genómica. Estudos anteriores indicaram uma desmetilação do DNA em grande escala durante o desenvolvimento embrionário pré-implantação. No entanto, dados de pesquisas atuais sugerem que, após a fertilização pelo esperma e fusão do oócito, juntamente com uma massiva desmetilação do DNA em embriões humanos precoces, também ocorre uma extensa metilação de novo altamente específica. Isso implica que o 'resultado líquido' da desmetilação global do DNA durante a primeira ronda de reprogramação do metiloma do DNA em embriões humanos precoces se manifesta, na verdade, como um equilíbrio dinâmico produzido pelo confronto do extenso processo organizado de desmetilação do DNA e da metilação localizada. Metilação do DNA.

Métodos

Resultados

Nesta investigação, realizámos uma análise de sequenciação do metiloma de DNA PBAT a nível de célula única numa coorte composta por 480 células individuais. Esta coorte incluiu 50 oócitos humanos, consistindo em 42 oócitos maduros e 8 oócitos de vesícula germinativa (GV), juntamente com 23 células espermáticas únicas e 62 embriões pré-implantação. O esforço de sequenciação resultou num conjunto de dados substancial, totalizando 6,5 Terabytes. Em média, cada célula individual foi sequenciada com 8,4 Gigabytes, facilitando a cobertura de aproximadamente 10,8 milhões de locais CpG (≥1×). Notavelmente, a nossa análise identificou 3 oócitos aneuploides e 33 embriões com pelo menos um blastómero aneuploide. Estes espécimes aberrantes foram posteriormente excluídos de uma análise mais aprofundada.

Uma investigação detalhada revelou três ondas de desmetilação global durante o desenvolvimento do embrião pré-implantação. A primeira onda, que ocorre nas primeiras 10 a 12 horas após a fertilização, demonstrou uma diminuição significativa nos níveis de metilação do DNA tanto nos genomas paterno quanto materno. Ondas subsequentes de desmetilação foram observadas desde o zigoto tardio até o estágio de duas células e do estágio de oito células até o estágio de mórula, com dinâmicas de metilação distintas em regiões genómicas enriquecidas para potenciadores, corpos de genes, íntrons e SINEs.

Fig. 1. Padrões de metilação de novo em embriões humanos precoces.

Além disso, foram observados eventos drásticos de metilação de DNA de novo durante o desenvolvimento pré-implantacional, particularmente durante duas ondas distintas: desde o estágio inicial do pronúcleo masculino até o estágio médio do pronúcleo e desde o estágio de quatro células até o estágio de oito células. Estas regiões metiladas de novo estavam predominantemente enriquecidas para elementos repetidos, como SINEs, LINEs e LTRs, sugerindo um mecanismo para reprimir a sua atividade transcricional.

Fig. 2. Dinâmicas de metilação do DNA de regiões metiladas de novo e análise de enriquecimento de regiões de desmetilação.
Além disso, foram elucidadas as diferenças nas dinâmicas de desmetilação entre os genomas paterno e materno, com o genoma paterno a apresentar taxas de desmetilação mais rápidas do que o genoma materno durante os estágios embrionários iniciais. Notavelmente, o padrão de metilação que favorece o genoma materno persistiu ao longo do desenvolvimento pré-implantacional e pós-implantacional em linhagens embrionárias e extra-embrionárias.

Finalmente, a análise das regiões diferencialmente metiladas (DMRs) entre oócitos e espermatozoides revelou locais genómicos específicos enriquecidos em DMRs paternos e maternos. Estas descobertas sublinham padrões de metilação de DNA específicos dos progenitores que desempenham papéis fundamentais na modulação da expressão génica e na impressão genómica ao longo do desenvolvimento embrionário.

Fig. 3. Caracterização de regiões diferencialmente metiladas específicas de gametas.

Conclusão

Nesta investigação, embarcámos numa jornada para aprofundar as intrincadas dinâmicas da reprogramação da metilação do DNA a nível de célula única. Aproveitando a tecnologia de sequenciação de alta capacidade de última geração, iniciámos uma análise de metilação do DNA em todo o genoma a nível de célula única. Esta abordagem pioneira permitiu-nos examinar sistematicamente estágios cruciais do desenvolvimento embrionário humano pré-implantação com uma precisão sem precedentes, desvendando insights a uma resolução de célula única e base única. As nossas explorações resultaram em várias descobertas marcantes:

(1) Revelando metilação de DNA de novo específica: Pela primeira vez, revelámos a presença de um volume substancial de metilação de DNA de novo específica ao longo do desenvolvimento embrionário humano pré-implantação.
(2) Revelações sobre a dinâmica de metilação do genoma parental: Numa revelação inovadora, observámos uma reversão nos níveis de metilação residual nos genomas parentais, começando a partir do estágio de embrião de duas células. Curiosamente, dentro da mesma célula única, os níveis de metilação residual no genoma materno superaram significativamente os do genoma paterno.
(3) Perspectivas sobre a distribuição assimétrica da metilação do DNA: O nosso estudo revelou, pela primeira vez, que a distribuição assimétrica da metilação do DNA durante a clivagem embrionária inicial tem potencial como ferramenta para rastrear a linhagem genética de células individuais dentro do mesmo embrião.

Referência:

1. Zhu P, Guo H, Ren Y, et al. Sequenciação do metiloma de DNA a nível de célula única em embriões humanos pré-implantação. Genética da Natureza, 2018, 50(1): 12-19.