Olá-SSRseq

A Introdução do Hi-SSRseq

Microssatélites (repetições em tandem curtas, STR, ou repetições de sequência simples, SSR) são marcadores amplamente utilizados em genética populacional. Apesar de a genotipagem precisa e eficiente de SSRs constituir a base dos SSRs como um marcador genético eficaz com várias aplicações, a falta de uma tecnologia de alto rendimento para a genotipagem de SSR limitou o seu uso como alvos genéticos em muitas culturas. Polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) ou polimorfismos de inserções/deleções (indel) na sequência nucleotídica desse fragmento, seja dentro do arranjo repetitivo ou nas regiões flanqueadoras (FR), permanecem indetectáveis apenas pela avaliação do comprimento. Além disso, indels nas regiões flanqueadoras podem ser erroneamente confundidos com mutações de tamanho do SSR.

Como consequência, a avaliação tradicional do comprimento de fragmentos pode levar à subestimação da variabilidade genética, a resultados imprecisos ou até mesmo a interpretações evolutivas erradas. Para superar tais erros, é necessária informação sobre a sequência de nucleotídeos de cada alelo. A CD Genomics forneceu uma tecnologia chamada Hi-SSRseq que combinou a amplificação multiplexada de SSRs tradicionais com sequenciação de alto rendimentoEste método pode genotipar muitos loci SSR em centenas de amostras com resultados altamente precisos, devido à cobertura substancial proporcionada pelo sequenciamento de alto rendimento, que também reduz significativamente o custo e o tempo de genotipagem, e a comparação entre amostras pode ser baseada diretamente na sequência de bases.

Os nossos objetivos foram (a) gerar dados de sequência de nucleotídeos de várias espécies de plantas não-modelo, para as quais não existiam dados genómicos anteriores, tanto das SSR como das regiões flanqueadoras, (b) registar o comprimento da região repetitiva, bem como a variação de SNP e indel dentro da SSR e da FR, (c) estimar a quantidade de homoplasia de tamanho molecularmente acessível de cada locos, e (d) comparar o grau de variabilidade genética entre diferentes conjuntos de dados com base no número de unidades repetidas, comprimento do fragmento e identidade de sequência.

Aplicações do Hi-SSRseq

• Análise genética
• Mapeamento fino
• Mapeamento de locus de características quantitativas (QTL)
• Seleção assistida por marcadores (SAM) na reprodução

Principais Características e Vantagens do Hi-SSRseq

• Alto Débito: muitos loci SSR podem ser genotipados em centenas de amostras com resultados altamente precisos.
• Custo Eficaz: Os custos do ensaio são significativamente inferiores à maioria dos outros. Genotipagem SSR plataformas.
• Fluxo de Trabalho Simplificado.
• Resultados Mais Precisos: Evitar subestimar a variabilidade genética, interpretações evolutivas erradas.

Workflow Hi-SSRseq

Especificações do Serviço

	Requisitos de Amostra Quantidade de ADN ≥ 50 ng (Painel único) Concentração de DNA ≥ 20 ng/μL As amostras de DNA requerem um OD260/280 o mais próximo possível de 1,8~2,0. Todo o ADN deve ser tratado com RNase e não deve apresentar degradação ou contaminação. Nota: Os montantes de amostra são apresentados apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.
Clique	Estratégia de Sequenciamento Cobertura de sequenciação: 1000X~5000X (De acordo com o múltiplo cromossómico da espécie, como diploide 1000 X; tetraploide 2500 X; hexaploide 5000 X) Plataforma Illumina MiSeq (2 × 250 pb em pares)
	Análise Bioinformática Fornecemos múltiplas análises de bioinformática personalizadas: Controlo de qualidade de dados Alinhamento de sequências Montagem do genoma Deteção de SSR Design de primers SSR Análise de polimorfismo SSR Nota: Os dados recomendados e os conteúdos de análise apresentados são apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Dados brutos
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes em Hi-SSRseq para a sua escrita (personalização)

Com plataformas de sequenciação de última geração e uma colaboração profunda com técnicos e cientistas altamente experientes em vários departamentos da CD Genomics, é oferecida uma técnica Hi-SSRseq que permite genotipar centenas de indivíduos em muitos loci SSR personalizados simultaneamente, combinando PCR multiplex e sequenciação Illumina. Se tiver requisitos adicionais ou perguntas, não hesite em contactar-nos.

Referências

1. Petra Šarhanová, Simon Pfanzelt, Ronny Brandt, Axel Himmelbach e Frank R. Blattner. SSR-seq: Genotipagem de microssatélites usando sequenciação de nova geração revela um nível mais elevado de polimorfismo em comparação com a pontuação tradicional de tamanho de fragmento. Ecologia e Evolução. 2018;8:10817–10833.
2. Jingjing Yang, Jian Zhang, Ruixi Han, Feng Zhang, Aijun Mao, Jiang Luo, Bobo Dong, Hui Liu, Hao Tang, Jianan Zhang e Changlong Wen. Target SSR-Seq: Uma Nova Tecnologia de Genotipagem SSR Associada a SSRs Perfeitos na Análise Genética de Variedades de Pepino. Frontiers in Plant Science. 2019; 10:1-12.

Resultados da Demonstração

Os resultados parciais estão mostrados abaixo:

Perguntas Frequentes sobre Hi-SSRseq

1. Que tipo de apoio está disponível durante o processo Hi-SSRseq?

Oferecemos apoio abrangente durante todo o processo de Hi-SSRseq, incluindo:

• Assistência Técnica: Orientação sobre preparação de amostras, construção de bibliotecas e interpretação de dados.
• Análise de Dados: Análise especializada de dados de sequenciação e identificação de SSRs.
• Consulta: Atualizações regulares e consultas para abordar quaisquer questões ou problemas.

2. Como é que o Hi-SSRseq difere da genotipagem SSR tradicional?

Tradicional Genotipagem SSR frequentemente depende da avaliação do comprimento dos fragmentos, que pode ser limitada por questões como homoplasia de tamanho e incapacidade de detectar polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) ou inserções/deleções (indels) em regiões adjacentes. No entanto, o Hi-SSRseq utiliza sequenciação de alto rendimento fornecer dados detalhados da sequência de nucleotídeos para cada locus SSR, melhorando a precisão e evitando interpretações erradas comuns relacionadas apenas ao comprimento do fragmento.

3. Como é que o Hi-SSRseq melhora a análise genética em comparação com os métodos tradicionais?

Hi-SSRseq fornece dados de sequência detalhados que melhoram a análise genética ao:

• Reduzindo a Homoplasia de Tamanho: Abordando interpretações erradas relacionadas ao comprimento dos fragmentos.
• Detecção de SNPs e Indels: Identificação de variações em SSR e regiões flanqueadoras.
• Aumentando a Precisão: Oferecendo interpretações evolutivas precisas e estimativas de variabilidade genética.

4. Como são identificados e analisados os SSRs no Hi-SSRseq?

As SSRs são identificados através da análise dos dados de sequenciação para detectar sequências de DNA repetitivas. Ferramentas e algoritmos de bioinformática são utilizados para:

• Alinhar Sequências: Mapear as leituras a um genoma de referência.
• Detetar Repetições: Identificar e classificar SSRs com base nas unidades de repetição e comprimento.
• Filtrar Dados: Selecionar SSRs significativos com base em critérios pré-definidos.
• Anotar: Fornecer contexto funcional e genómico para cada SSR.

Estudos de Caso Hi-SSRseq

O legado genético da fragmentação e sobreexploração na ameaçada árvore de casca de pimenta medicinal africana, Warburgia salutaris

Revista: Relatórios Científicos
Fator de impacto: 4,997
Publicado: 12 de novembro de 2020

Fundo

As plantas medicinais são vitais em todo o mundo, especialmente em regiões em desenvolvimento. A rica diversidade de plantas da África subsaariana está ameaçada por atividades humanas. Warburgia salutaris, uma planta medicinal chave no sul de África, enfrenta um grave risco de extinção devido à colheita excessiva. Os investigadores desenvolveram marcadores SSR para avaliar a diversidade genética e a estrutura da planta, com foco em Moçambique, para informar os esforços de conservação e reintrodução.

Materiais e Métodos

Resultados

1. Diversidade Genética

O estudo identificou 58 alelos em 10 loci SSR em Warburgia salutaris, com contagens de alelos variando de três a nove por locus. A heterozigose observada média variou de 0,299 a 0,852, enquanto a heterozigose esperada variou de 0,249 a 0,812. A diversidade foi mais alta na área de LM, com um índice de diversidade de Shannon superior em comparação com as áreas de TR e FC. O conteúdo de informação polimórfica foi elevado, e os coeficientes de endogamia foram baixos em todas as áreas.

Tabela 1 Características e estatísticas de diversidade genética dos 10 marcadores microssatélites polimórficos desenvolvidos para Warburgia salutaris.

2. Estrutura Genética Populacional e Diferenciação

A análise STRUCTURE revelou dois principais clusters genéticos: um nas áreas de LM e TR e outro na área de FC. As análises de PCoA e da árvore de vizinhos mais próximos apoiaram estas descobertas, mostrando que as populações de FC estavam claramente separadas, enquanto as de LM e TR estavam mais misturadas. Os valores de FST pareados indicaram uma diferenciação genética moderada entre FC e as outras áreas, com uma diferenciação menor entre TR e LM.

Fig 1. Estrutura populacional de Warburgia salutaris com base em 10 SSRs e utilizando o melhor resultado de atribuição obtido pelo STRUCTURE.

Fig 2. Árvore de vizinhos não enraizada dos estudados Warburgia salutaris baseado na distância genética de Nei.

Conclusão

Warburgia salutaris mostra uma alta diversidade genética e admissão, apesar das fortes pressões de colheita, com marcadores SSR a revelarem um polimorfismo substancial e baixa endogamia. A espécie exibe uma diferenciação genética significativa entre as populações do norte e do sul, influenciada por diferenças de habitat. Os esforços de conservação devem concentrar-se na manutenção da diversidade genética através da cultura ex situ, programas de reintrodução e educação das comunidades locais, ao mesmo tempo que consideram estratégias de conservação transfronteiriças.

Referência

1. Senkoro AM, Talhinhas P, Simões F, Batista-Santos P, Shackleton CM, Voeks RA, Marques I, Ribeiro-Barros AI. O legado genético da fragmentação e sobreexploração na ameaçada árvore medicinal de casca de pimenta africana, Warburgia salutaris. Relatórios científicos. 2020, 10(1):19725.