Diretrizes para Submissão de Amostras
Por que quantificar o número de cópias de DNA mitocondrial?
O número de cópias de DNA mitocondrial (mtDNA-CN) reflete o número de genomas mitocondriais por célula. Este parâmetro é fundamental biomarcador da atividade mitocondrial e saúde bioenergética celular.
Principais Razões Pelas Quais os Investigadores Escolhem a Quantificação de mtDNA-CN
- Biologia do câncer e diagnósticos
A mtDNA-CN é frequentemente alterada em diferentes tipos de câncer. Em muitos tumores—especialmente na bexiga, mama e rim—é mais baixa em comparação com o tecido normal. Quantificar esta alteração através de um ensaio de número de cópias de mtDNA apoia a descoberta de biomarcadores e a avaliação terapêutica. - Doenças relacionadas com a idade e metabólicas
Baixos níveis de CN de mtDNA correlacionam-se com o envelhecimento, doenças cardiovasculares, disfunção renal crónica e aumento da mortalidade. A quantificação precisa do número de cópias de DNA mitocondrial auxilia estudos em metabolismo, fragilidade, neurodegeneração e intervenções no envelhecimento. - Desenvolvimento terapêutico e testes de toxicidade
Alterações na CN do mtDNA podem indicar disfunção mitocondrial causada por medicamentos ou stress ambiental. Integrado nos pipelines de CRO, o qPCR do número de cópias de mtDNA ajuda a sinalizar toxicidade mitocondrial e a comparar os efeitos dos compostos. - Avaliação metodológica e normalização
Várias plataformas (qPCR, WGS, microarrays) podem medir a CN do mtDNA, mas estudos mostram que o qPCR continua a ser uma opção custo-efetiva e rápida—desde que a extração de DNA e o design do ensaio sejam otimizados.
O que é o número de cópias de ADN mitocondrial?
As mitocôndrias contêm centenas a milhares de genomas mitocondriais por célula, variando conforme o tecido e a fisiologia. Medindo número de cópias de mtDNA por célula quantifica o conteúdo e a biogénese mitocondrial.
Avaliação das Técnicas de Estimativa do Número de Cópias de mtDNA
Entre os ensaios, a qPCR continua a ser o padrão-ouro, oferecendo alta sensibilidade (>30 pg), rápida resposta e elevado rendimento. Suporta quantificação em tubo único com deteção de dupla meta (mtDNA vs DNA nuclear), produzindo resultados fiáveis quando se utilizam primers e sondas TaqMan validadas.
O nosso ensaio de qPCR para o número de cópias de mtDNA 🧪
Oferecemos uma precisão número de cópias de mtDNA qPCR serviço utilizando um ensaio baseado em sonda TaqMan que mede simultaneamente o DNA mitocondrial e nuclear numa única reação. Este método garante precisão quantificação do número de cópias de DNA mitocondrial com um desempenho robusto em diversos tipos de amostras.
Visão Geral do Ensaios e Tecnologia
- A química da sonda de hidrolise TaqMan aumenta a especificidade: a exonuclease 5′–3′ cliva a sonda apenas quando ligada ao alvo—produzindo fluorescência diretamente proporcional à quantidade de DNA alvo.
- Alvejamos uma região conservada do mtDNA com primers e uma sonda projetados à medida para evitar a amplificação de pseudogenes mitocondriais nucleares (NUMTs).
- Um gene nuclear de referência (por exemplo, IFNB1 ou B2M) é amplificado em paralelo para normalização, permitindo o cálculo preciso da razão mtDNA/nDNA por célula.
Métricas de Desempenho
- Alta sensibilidade: deteta de forma fiável até ~30 pg de DNA de entrada.
- Precisão excecional: coeficiente de variação (CV) < 5% para valores de Cq; CV < 15% para cópias calculadas por célula.
- Amplitude dinâmica ampla: validada através de diluições seriadas, fornecendo curvas padrão lineares (eficiência 90–110%).
Design de Primers e Probes
- Os primers de mtDNA são mapeados para a região D-loop ou ND1—escolhidos pela alta conservação e ausência de homologia com NUMT.
- O primer de referência nuclear corresponde a um gene de cópia única (amplicão de 110 bp).
- Todos os desenhos são rigorosamente avaliados quanto à especificidade com curvas de fusão, eletroforese em gel e verificações in-silico com BLAST.
Quantificação de Número de Cópias em Um Passo
- Amplificação de dupla alvo (mtDNA + nDNA) em um poço.
- Número de cópias relativo: calculado através do método ΔΔCq.
- Número absoluto de cópias: comparando com curvas padrão de ADN de referência com mtDNA-CN conhecido.
Evitação de Alvos Indesejados
- Projetado para excluir amplicões não humanos e derivados de NUMT—confirmado por altos valores de Cq ou sem sinal nos controles negativos/sem template.
- A análise de curva de fusão garante um pico de amplificação único e específico, evitando dímeros de primers ou produtos não específicos.
Tabela: Sequências de Primers Utilizadas na Nossa Análise de qPCR do Número de Cópias de mtDNA
| Gene Alvo | Nome do Primer | Direção | Sequência (5′ → 3′) | Comprimento (pb) |
|---|---|---|---|---|
| mt-ND1 | mt-ND1-F | Para a frente | TACGGGCTACTACAACCCTTC | 21 |
| mt-ND1 | mt-ND1-R | Reverter | ATGGTAGATGTGGCGGGTTT | 20 |
| mt-ND5 | mt-ND5-F | Encaminhar | CATTACTAACAACATTTCCCCCGC | 24 |
| mt-ND5 | mt-ND5-R | Inverter | GGCTGTGAGTTTTAGGTAGAGGG | 23 |
| (Control) | SERPINA1-F | Para a frente | CAGTGAATAAATGAGGCGTACATCC | 25 |
| (Control) | SERPINA1-R | Reverter | GACTGTTTCTCATGCCTCTGGAAAG | 25 |
Nota: Para a estimativa do número de cópias de mtDNA, mt-ND1 é o alvo principal. A SERPINA1 pode servir como um gene de referência nuclear (dependendo do contexto). Nenhuma sequência de sondas TaqMan foi listada; se as sondas também estiverem disponíveis, posso incluí-las..
Visão Geral do Fluxo de Trabalho🔬
Passo 1: Chegada da Amostra e QC
- Receber sangue, tecido, células ou gDNA purificado
- Inspecione a rotulagem, a integridade do tubo e as condições de armazenamento.
- Realize a quantificação de ADN (A260/280 ~1.8) e verifique a entrada (≥ 5 ng)
Passo 2: Extração de DNA (se necessário)
- Utilize solventes orgânicos ou kits comerciais.
- Prefira métodos orgânicos para manter um rendimento consistente de mtDNA/nDNA.
Passo 3: Preparação e Execução do qPCR
- Preparar ensaio TaqMan duplex (mtND1/ND5 + referência nuclear)
- Executar em triplicado com controles positivos, sem modelo e sem humanos.
Passo 4: QC de Dados e Análise
- Assegure-se de que os replicados em triplicado Cq tenham um desvio padrão <0,5.
- Verifique as curvas de amplificação e derretimento para especificidade.
- Calcule ΔCq e o número absoluto de cópias de mtDNA em relação à curva padrão.
Passo 5: Entrega do Relatório
- Fornecer relatório PDF detalhado com gráficos de dados e métricas de QC.
- Fornecer ficheiros de dados brutos, resumo da análise e notas de interpretação.
- Carregue todos os entregáveis para o nosso portal online seguro.
Aplicações de Pesquisa
Investigação do câncer
Detetar a depleção ou amplificação de mtDNA em tumores versus tecidos normais adjacentes.
Estudos sobre envelhecimento e longevidade
Monitorizar o declínio mitocondrial com a idade ou após intervenções (dieta, medicamentos, exercício).
Distúrbios metabólicos e mitocondriais
Identificar alterações na mtDNA-CN relacionadas com diabetes, obesidade ou mutações herdadas de mtDNA.
Exposição ambiental e ocupacional
Avaliar a toxicidade mitocondrial devido a poluentes, radiação ou produtos químicos.
Farmacologia e toxicologia
Avaliar o stress mitocondrial induzido por fármacos em estudos de segurança pré-clínicos.
Engenharia celular e triagens CRISPR
Confirme os efeitos mitocondriais de edições genéticas ou tratamentos com pequenas moléculas.
Por que escolher a CD Genomics?
✅ Precisão Científica
Utilizamos ensaios de qPCR duplex validados com um design rigoroso de primers e sondas. Cada resultado é suportado por curvas de amplificação controladas por qualidade, verificação de curvas de fusão e calibração de curvas padrão.
✅ Compatibilidade de Amostras Flexível
Desde sangue total a saliva, tecidos e células cultivadas, a nossa plataforma acomoda uma ampla variedade de tipos de entrada—assegurando uma quantificação consistente da razão mtDNA/nDNA em diversos modelos de investigação.
✅ Transparência de Dados de Ponta a Ponta
Os nossos entregáveis incluem condições de ensaio completas, métricas de QC, ficheiros de dados brutos e saídas de número de cópias normalizadas—prontas para interpretação posterior ou documentação regulatória.
✅ Confiabilidade de Grau CRO
Os nossos fluxos de trabalho cumprem os padrões de investigação e pré-clínicos. Quer esteja a realizar estudos mecanicistas, triagens de toxicidade ou descoberta de biomarcadores, ajudamos a garantir a integridade dos dados em cada etapa.
Entregáveis
- Relatório PDF Abrangente
Inclui uma visão geral da metodologia, sequências de primers/probes, condições de reação, curvas de amplificação e de fusão, valores de Cq, curvas padrão e a razão normalizada mtDNA/nDNA, com bandeiras de qualidade para transparência. - Exportação de Dados Brutos
Ficheiros de qPCR (.csv, .xlsx) contendo limiares de ciclo e layout de placas para integração com pipelines de análise de dados do cliente. - Validação da Curva Padrão
Demonstrou linearidade do ensaio (R² >0,99, eficiência 90–110%) e calibração do número absoluto de cópias. - Métricas de Garantia da Qualidade
Coeficiente de variação (CV) para Cq <5% e estimativas de cópias por célula <15%, em conformidade com o desempenho do kit RayBio. - Resumo da Interpretação
Contexto científico breve descrevendo se a mtDNA-CN apresenta depleção ou elevação em relação aos limiares de controlo. - Acesso ao Portal de Dados Seguro
Relatório em PDF e dados brutos acessíveis através da plataforma online em conformidade da CD Genomics.
Requisitos de Amostra
| Tipo de Amostra | Formato e Quantidade Requeridos | Entrada de DNA Recomendada |
|---|---|---|
| Sangue total | Túbulos de EDTA/heparina, 1–5 mL | ≥ 5 ng por reação de qPCR |
| PBMCs | 1–5×10⁶ células, frescas ou congeladas | ≥ 5 ng por reação |
| Tecido (congelado/fresco) | ≥ 10 mg (congelado rapidamente/RNAlater) | ≥ 5 ng por reação |
| Células cultivadas | ≥ 1×10⁶ células | ≥ 5 ng por reação |
| Saliva / swab bucal | Coletado em tampão estabilizador de DNA | ≥ 5 ng por reação |
| Urina / LCR / lavagem | volume de 1–5 mL | Variável; objetivo ≥ 5 ng se possível |
| gDNA purificado | A260/280 ≈ 1,8–2,0; baixa fragmentação | ≥ 0,1 ng por reação |
1. O que é o número de cópias do ADN mitocondrial?
O número de cópias de ADN mitocondrial (mtDNA-CN) refere-se ao número médio de cópias do genoma mitocondrial por célula. É um indicador chave da função mitocondrial, e desvios—seja por depleção ou amplificação—estão associados a várias condições como cancro, envelhecimento e doença renal.
2. Por que usar qPCR para a quantificação do número de cópias de mtDNA?
A qPCR em tempo real é o padrão ouro para a quantificação do número de cópias de mtDNA devido ao seu equilíbrio entre sensibilidade (até ~30 pg de DNA), eficiência, especificidade e capacidade de processamento. Supera as microarrays em custo e velocidade, tornando-a ideal para fluxos de trabalho impulsionados por CRO.
3. Quão precisa é a abordagem qPCR?
- Execuções em triplicado com SD < 0,5 garantem precisão.
- A sensibilidade do ensaio permite a deteção de diferenças subtis, embora alterações inferiores a 2 vezes possam comprometer a precisão.
- Estudos de validação cruzada, incluindo a COMPARAÇÃO PLOS de qPCR vs WGS/WES, confirmam a fiabilidade do qPCR para a estimativa de mtDNA.
4. Quais amostras são compatíveis com o seu ensaio?
Aceitamos sangue EDTA, PBMCs, vários tipos de tecidos, células cultivadas, saliva, urina, LCR e gDNA purificado. Seguimos protocolos validados adaptados ao tipo de amostra, garantindo uma análise consistente e fiável do número de cópias de mtDNA.
5. Este serviço pode detectar variações no número de cópias de mtDNA em estudos de cancro?
Absolutamente. A alteração do mtDNA-CN está bem documentada em vários tipos de câncer, incluindo câncer de mama, rim e bexiga. O nosso ensaio de número de cópias de mtDNA fornece dados quantitativos para apoiar estudos de biomarcadores de câncer e estudos mecanísticos.
6. Como lida com as sequências mitocondriais nucleares (NUMTs)?
O nosso ensaio utiliza primers e sondas que visam regiões altamente conservadas do genoma mitocondrial (por exemplo, ND1, ND5) e inclui uma referência de um gene nuclear curto. Este design evita a co-amplificação de NUMTs. Os controlos de curva de fusão e de ausência de template garantem ainda mais a especificidade.
7. Pode o DNA de baixa qualidade ou fragmentado ser quantificado com precisão?
Embora a qPCR funcione melhor com DNA intacto, os nossos ensaios toleram fragmentação moderada (<120 bp alvos). Testes de controlo de qualidade em série de qPCR também podem detetar DNA degradado e excluir amostras imprecisas.
