Sistema SNaPshot Multiplex para Genotipagem de SNPs

A CD Genomics oferece genotipagem de SNP utilizando o simples e acessível Sistema Multiplex SNaPshot para permitir resultados eficientes e rápidos.

O que é o Genotipagem SNaPshot?

O Sistema SNaPshot Multiplex é um sofisticado Genotipagem de SNPs tecnologia desenvolvida pela Applied Biosystems (ABI). Frequentemente referida como "mini-sequenciação", este método baseia-se em princípios de extensão de base única rotulada fluorescentemente. Destaca-se na genotipagem de múltiplos polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) simultaneamente dentro de uma única reação. A tecnologia central do SNaPshot envolve o uso de didesoxinucleotídeos (ddNTPs) marcados fluorescentemente para terminar a extensão dos primers de DNA após a adição de um nucleotídeo, permitindo a determinação precisa dos SNPs com base na fluorescência emitida.

Figura 1. Esquema do princípio do ensaio SNaPshot.

Como funciona um ensaio SNaPshot?

O ensaio SNaPshot opera através de um fluxo de trabalho metódico e eficiente que abrange várias etapas cruciais:

• Desenho de PrimersOs primers específicos são meticulosamente desenhados para se ligarem imediatamente a montante dos locais de SNP de interesse. Estes primers variam em comprimento, permitindo a diferenciação entre SNPs durante as análises subsequentes.
• PCR multiplexoNeste passo, é realizada uma reação em cadeia da polimerase multiplex (PCR) para amplificar regiões que contêm os SNPs alvo. Isto envolve o uso de múltiplos primers dentro de uma única reação para gerar produtos de PCR que abrangem múltiplos loci SNP, aumentando assim a capacidade de processamento e a eficiência.
• Extensão de Base ÚnicaDentro da mistura de reação, que contém enzimas de sequenciação e quatro ddNTPs marcados com fluorescência, os primers sofrem uma extensão de base única. Cada ddNTP é marcado com um corante fluorescente distinto correspondente a um dos quatro nucleotídeos (adenina, timina, citosina, guanina), fornecendo uma assinatura única para cada base.
• Deteção e AnáliseOs produtos expandidos passam por eletroforese capilar, onde os sinais fluorescentes emitidos pelos ddNTPs são detetados e registados. O eletroferograma exibe picos, onde a posição de cada pico correlaciona-se com a localização do SNP e a sua cor identifica o nucleótido específico.
• Interpretação de DadosA saída do eletroferograma é analisada utilizando software especializado para determinar os genótipos SNP com base nas distintas cores e posições dos picos.

Esta abordagem facilita a análise simultânea de até 16 SNPs numa única reação, tornando-a altamente eficiente para projetos de genotipagem de média capacidade.

Introdução ao Serviço de Genotipagem SNaPshot

A CD Genomics oferece serviços extensivos de genotipagem SNaPshot adaptados para atender a diversas necessidades de pesquisa. Aproveitando a tecnologia SNaPshot de ponta, a CD Genomics garante genotipagem de SNP em alta capacidade com precisão e eficiência incomparáveis. O nosso conjunto de serviços inclui:

• Desenho de Primers PersonalizadosPrimers especificamente concebidos para direcionar os seus SNPs de interesse.
• PCR multiplexo e Extensão de Base ÚnicaProtocolos otimizados garantem resultados precisos e fiáveis.
• Eletroforese Capilar AvançadaUso de tecnologia de ponta para deteção precisa de SNP.
• Análise de DadosInterpretação especializada de eletroferogramas utilizando software de ponta.

O nosso serviço de genotipagem SNaPshot suporta projetos que envolvem a análise de 8 a 16 SNPs em várias centenas a milhares de amostras, tornando-o particularmente adequado para estudos genéticos em grande escala e aplicações.

Vantagens do Serviço de Genotipagem SNaPshot

A genotipagem SNaPshot oferece várias vantagens distintas:

• Alta PrecisãoO método SNaPshot alcança uma taxa de precisão de até 99,9%, proporcionando genotipagem de SNP precisa que rivaliza com os métodos de sequenciação tradicionais em fiabilidade.
• Multiplexação SimultâneaCapaz de analisar até 16 SNPs numa única reação, reduzindo significativamente o tempo e o custo associados à análise genética.
• FlexibilidadeAdaptável a uma ampla gama de quantidades de amostras, desde algumas centenas até vários milhares, acomodando diferentes escalas de investigação.
• Aplicabilidade AmplaEficaz para diferentes tipos de SNP, incluindo aqueles envolvidos em traços genéticos complexos, sem limitações impostas pelas características de polimorfismo dos SNP.
• Custo-efetivoComparado com abordagens de sequenciamento completo, o SNaPshot oferece uma solução económica para genotipagem em alta capacidade, fornecendo resultados de alta qualidade a um custo inferior.

Aplicações da Genotipagem SNaPshot

A tecnologia de genotipagem SNaPshot encontra aplicação em diversos contextos de investigação e clínicos, incluindo:

• Estudos de Associação GenéticaIdentificação de variantes genéticas associadas a doenças ou características.
• Genética PopulacionalInvestigação da diversidade genética e das relações evolutivas dentro e entre populações.
• FarmacogenómicaExplorando fatores genéticos que influenciam as respostas a medicamentos, crucial para a medicina personalizada.
• Genética Agrícola: Melhorar os programas de reprodução através da identificação de marcadores genéticos associados a características desejáveis em culturas e gado.

A versatilidade e precisão do SNaPshot tornam-no uma ferramenta inestimável tanto na investigação académica como em estudos genéticos aplicados, oferecendo capacidades robustas para uma multitude de investigações genéticas.

Fluxo de Trabalho de Genotipagem SNaPshot

Em primeiro lugar, os primers são utilizados para amplificar o fragmento alvo dos SNPs, e o Exo I e a Fosfatase Alcalina de Camarão (SAP) são adicionados aos produtos de amplificação para digerir os primers e os dNTPs restantes. Em seguida, os produtos purificados são utilizados como templates, e a PCR é realizada utilizando a enzima de sequenciação, quatro ddNTPs marcados com fluorescência e os primers de extensão terminal 5' próximos ao local do SNP. Os primers estendem apenas uma base. Após o sequenciador ABI, os loci SNP correspondentes são determinados de acordo com a posição e a cor do pico. De acordo com a cor do pico, podemos saber o tipo da base e identificar a sequência genética da amostra. É normalmente utilizado para análise de 3 a 30 locais SNP. Um sistema típico de SNaPshot Multiplex para o fluxo de trabalho de genotipagem de SNP é mostrado a seguir:

Especificações do Serviço

	Requisitos de Amostra DNA genómico, tecido fresco, sangue, amostras de células DNA genómico: Volume ≥20 μL, concentração ≥50 ng/µL Sangue ≥1 ml Célula ≥ 106 Tecido ≥ 300 mg, As amostras de ADN requerem um OD260/280 o mais próximo possível de 1,8~2,0. Todo o DNA deve ser tratado com RNase e não deve apresentar degradação ou contaminação. Nota: Os montantes de amostra são listados apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.
Clique	Estratégia de Sequenciamento Analisador de DNA ABI PRISM 3700
	Análise Bioinformática Fornecemos múltiplas análises de bioinformática personalizadas: Pacote de software ABI Genescan™ Pesquisa de doenças: análise de ligação e estudos de associação Identificação humana: testes forenses e de paternidade Pesquisa de diagnóstico molecular: Fragile X, fibrose quística (FQ) e ensaios de perda de heterozigosidade (LOH) Criação de gado: testes de paternidade animal e genotipagem animal Tipagem agrícola e microbiana: técnica de polimorfismo de comprimento de fragmento amplificado (AFLP®) Nota: Os dados recomendados e os conteúdos de análise apresentados são apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Ficheiros de dados brutos (.fsa)
• Ficheiros de eletroferograma (.pdf)
• Sequências de primers utilizadas em sistemas de amplificação e reação
• Resultados de genotipagem (.excel)

Com capacidade profissional em bioinformática, a CD Genomics oferece serviços de alta qualidade. Genotipagem de SNPs serviços para si. Se tiver alguma dúvida, não hesite em contactar-nos.

Resultados da Demonstração

Os resultados parciais estão mostrados abaixo:

Sistema SNaPshot Multiplex para FAQs de Genotipagem de SNP

1. O SNaPshot consegue detectar contaminação de amostras?

Sim, o ensaio SNaPshot pode identificar a presença de contaminação por DNA exógeno ao analisar as razões de altura dos picos duplos no eletroferograma. Este método fornece um meio fiável para avaliar a integridade da amostra.

2. O método SNaPshot pode detectar polimorfismos desconhecidos?

Sim, o método SNaPshot é capaz de detectar polimorfismos desconhecidos, desde que as sequências adjacentes ao local da mutação sejam conhecidas. Isso permite uma identificação precisa das bases no local alvo.

3. Pode o SNaPshot ser utilizado para análise de SNPs em genoma completo?

O ensaio SNaPshot é adaptado para genotipagem de SNPs direcionados, tornando-o altamente eficaz para analisar SNPs específicos em vez de realizar uma análise abrangente de SNPs em todo o genoma. Para estudos genómicos extensivos que exigem um exame amplo de SNPs em todo o genoma, outras tecnologias, como arrays de SNPs ou sequenciação de nova geração (NGS) oferecer maior cobertura e capacidade de transmissão.

Sistema SNaPshot Multiplex para Estudos de Caso de Genotipagem de SNPs

TIMD4 O SNP rs6882076 está associado a níveis reduzidos de triglicerídeos e ao risco de doença coronária e acidente vascular cerebral isquémico.

Revista: Jornal Internacional de Ciências Médicas

Fator de impacto: 3,2

Publicado: 2 de junho de 2019

Fundo

A doença coronária (DC) e o acidente vascular cerebral isquémico (AVCi) são grandes preocupações de saúde ligadas à aterosclerose e a fatores de risco comuns. Este estudo examinou a TIMD4 SNP rs6882076 utilizando a Tecnologia Snapshot em 1.765 indivíduos (581 com DC, 559 com AVE e 625 controlos) para explorar a sua associação com DC, AVE e níveis de lípidos séricos.

Materiais e Métodos

Resultados

O estudo comparou características clínicas e genéticas entre pacientes com CHD ou IS e controlos saudáveis. Constatou-se que os pacientes com CHD ou IS apresentavam maior peso corporal, IMC, pressão arterial sistólica, triglicerídeos (TG) e taxas de hipertensão, mas níveis mais baixos de colesterol total (CT), HDL-C, ApoA1 e razão ApoA1/ApoB em comparação com os controlos. TIMD4 O SNP rs6882076 mostrou diferentes frequências genotípicas e alélicas entre pacientes e controlos. Os portadores do alelo T apresentaram um risco reduzido tanto de DCC como de IS. Nos controlos, os portadores do alelo T tinham níveis de TG mais baixos em comparação com os não-portadores, embora isso não tenha sido significativo em pacientes com DCC ou IS. A análise multivariada identificou o consumo de álcool, um IMC elevado e a hiperlipidemia como fatores de risco tanto para DCC como para IS, enquanto o tabagismo foi um fator de risco para DCC, mas não para IS.

Tabela 2 Frequências Genotípicas e Alélicas do TIMD4 SNP rs6882076 e o Risco de DCA e IS [n (%)]

Tabela 3 O TIMD4 SNP rs6882076 e o Risco de DAC e IS de Acordo com o Género, Idade, Índice de Massa Corporal, Estado de Fumador e Consumo de Álcool

Conclusão

O TIMD4 O SNP rs6882076 está associado a níveis mais baixos de triglicerídeos (TG) no soro e a um risco reduzido de doença coronária (CHD) e acidente vascular cerebral isquémico (IS) na população Han do Sul da China. Os portadores do alelo T têm um risco diminuído de ambas as condições e níveis mais baixos de TG em comparação com os não portadores. Isso sugere que o SNP pode reduzir o risco de CHD e IS ao diminuir os níveis de TG no soro.

Referência:

1. Khounphinith E, Yin RX, Cao XL, et al. TIMD4 O SNP rs6882076 está associado a níveis reduzidos de triglicerídeos e ao risco de doença coronária e acidente vascular cerebral isquémico. Revista Internacional de Ciências Médicas2019, 16(6):864.