Diretrizes para Submissão de Amostras
O que é o sequenciamento do genoma T2T?
O genoma T2T refere-se a uma montagem de genoma sem lacunas que se estende de telómero a telómero, com lacunas mínimas apenas permitidas em regiões específicas, como o DNA ribossomal (rDNA), cromossomos sexuais e centrómeros. Esta montagem de genoma apresenta valores de qualidade (Q) excepcionalmente altos para precisão e pontuações BUSCO para completude, com erros estruturais mínimos entre os dados brutos e a montagem final.
Desde a publicação da sequência completa do cromossoma X humano na Nature em 2020, o Consórcio T2T tem trabalhado diligentemente para refinar e aperfeiçoar o genoma humano. Em 2022, o consórcio revelou a primeira sequência completa e sem lacunas do genoma humano. Este feito marcante revelou regiões segmentares duplicadas altamente idênticas e as suas variações dentro do genoma humano, marcando a primeira vez que estas áreas foram completamente caracterizadas. Este marco representa o início da era T2T na montagem do genoma.
Porquê T2T? A Limitação das Montagens Tradicionais
Na história da genómica, a "qualidade de referência" sempre veio acompanhada de um asterisco. Mesmo o genoma de referência humano de referência (GRCh38) deixou aproximadamente 8% da sequência não resolvidos devido a limitações tecnológicas. Estas peças em falta não são "DNA lixo"—são regiões biologicamente significativas enriquecidas com:
- Centromeros e Telómeros: Críticos para a estabilidade dos cromossomas e a divisão celular.
- Duplicaçõe Segmentais: Pontos quentes para evolução rápida e rearranjos associados a doenças.
- Satélites e Repetições: Repetições em tandem complexas que leituras curtas não conseguem mapear de forma única.
O lançamento do T2T-CHM13 o genoma humano marcou uma mudança de paradigma, provando que a montagem sem lacunas é possível. Em CD Genomics, democratizamos esta tecnologia, aplicando as mesmas estratégias rigorosas às suas espécies de pesquisa. Ao alcançar uma verdadeira montagem T2T, você obtém acesso à sequência completa de uma extremidade cromossómica à outra, permitindo a descoberta de novos variantes estruturais (SVs) e proporcionando uma base perfeita para estudos de Pan-genoma.
A Nossa Estratégia Tecnológica: A Sinergia HiFi + Ultra-Longa
Alcançar um genoma sem lacunas requer uma combinação estratégica de poder de sequenciação. Utilizamos uma abordagem de "Montagem Híbrida" que equilibra precisão com comprimento de leitura extremo.
1. Sequenciação HiFi da PacBio (O Âncora da Precisão)
Função: Fornece leituras longas de alta fidelidade (15-20 kb) com >99,9% de precisão.
BenefícioResolve a maioria das complexidades do genoma enquanto garante que a precisão a nível base (pontuação QV) da montagem final seja extremamente alta.
2. Sequenciação Ultra-Longa ONT (O Construtor de Pontes)
Papel: Fornece leituras ultra-longas (até 100kb+ ou até mesmo em escala de Mb).
BenefícioAbrange as maiores regiões repetitivas (como os arranjos de ADN ribossómico e os centrómeros) que nem mesmo as leituras HiFi conseguem unir. Isto "ancora" efetivamente os contigs em cromossomas completos.
3. Hi-C / Bionano (O Arquiteto de Estruturas)
PapelCaptura interacções de cromatina a longa distância.
BenefícioOrdena e orienta contigs em andaimes em escala de cromossoma, corrigindo quaisquer erros estruturais de montagem.
Estratégia de montagem T2T que combina a precisão do PacBio HiFi com leituras ultra-longas da Oxford Nanopore para resolver centrómeros e lacunas genómicas.
Portfólio de Serviços: Soluções T2T Personalizadas
A CD Genomics oferece uma variedade de tipos de serviços de sequenciação de genoma T2T flexíveis para atender a diferentes objetivos de pesquisa e requisitos orçamentais:
- Sequenciação do Genoma T2T
Ao integrar tecnologias avançadas como sequenciação de terceira geração e Hi-C, é alcançada uma montagem T2T "sem lacunas" para um ou mais cromossomas.
- Sequenciação do Genoma T2T Resolvido por Haplótipo
Incorpora a montagem do genoma resolvida por haplótipos, que diferencia os cromossomas herdados de cada progenitor, obtendo assim a informação genética completa de ambas as fontes, paterna e materna.
Sequenciação do Genoma T2T de Vertebrados
Os genomas de vertebrados são grandes (escala em Gb) e complexos. Oferecemos três níveis de estratégias de montagem para corresponder ao seu orçamento e objetivos de continuidade.
| Camada de Estratégia | Combinação de Tecnologia | Aplicação Ideal |
|---|---|---|
| Fundação T2T | PacBio HiFi apenas | Montagem de alta qualidade para genomas vertebrados menos repetitivos; excelente completude do espaço gênico. |
| T2T Avançado | PacBio HiFi + ONT Ultra-longo | Recomendado para resolver repetições complexas, centrómeros e alcançar uma continuidade quase sem falhas. |
| Platina T2T | PacBio HiFi + ONT Ultra-longo + Hi-C | O padrão definitivo. Anexa sequências a cromossomas para um acabamento verdadeiro de Telómero a Telómero. |
2. Sequenciação do Genoma T2T de Plantas
As plantas apresentam desafios únicos: alta ploidia, elementos repetitivos massivos e heterozigosidade extrema. Os nossos processos abordam especificamente esses obstáculos.
AlvoCulturas complexas, plantas medicinais e modelos evolutivos.
EstratégiaUtilizamos sequenciação HiFi de alta profundidade para distinguir entre haplótipos em espécies poliploides, combinada com leituras ultra-longas para abranger regiões massivas de transposões comuns em genomas de plantas.
3. Sequenciação do Genoma Bacteriano T2T
Para a microbiologia, "T2T" significa alcançar um único cromossoma circular fechado e plasmídeos totalmente montados sem lacunas.
MetodologiaAbordagem híbrida utilizando Leituras longas PacBio/ONT para montagem + Leituras curtas da Illumina (opcional) para Polimento (correção Pilon).
Entregável0 Lacunas, montagem completa de plasmídeos, padrões de metilação.
Fluxo de Trabalho do Serviço de Sequenciamento T2T
Na CD Genomics, oferecemos um serviço de sequenciação do genoma completo, integrado e de ponta a ponta, projetado para garantir resultados consistentes e de alta qualidade. O nosso fluxo de trabalho padronizado — desde a submissão da amostra até a entrega dos dados — é concebido para apoiar a reprodutibilidade, otimizar a investigação e acelerar a descoberta em todos os tipos de estudos.
- Preparação de AmostrasA extração de DNA de Alto Peso Molecular (HMW) é crítica. Garantimos que os fragmentos sejam longos o suficiente para a construção de bibliotecas ultra-longas.
- Construção de BibliotecaPreparação paralela de bibliotecas SMRTbell (PacBio) e bibliotecas LSK/ULK (ONT).
- SequenciaçãoSequenciação de alta profundidade nas plataformas PacBio Revio/Sequel IIe e Oxford Nanopore PromethION.
- MontagemUtilização de montadores específicos de T2T (por exemplo, Hifiasm, Verkko) para integrar tipos de dados.
- Polimento e QCCorreção de erros e avaliação rigorosa usando pontuações QV e Busco.
- AnotaçãoPredição de genes e anotação funcional das regiões recentemente reveladas.
Figura 1. O Fluxo de Trabalho T2T da CD Genomics.
Análise Bioinformática de Sequenciação Genómica T2T
A CD Genomics oferece soluções abrangentes e flexíveis. serviços de análise bioinformática, variando desde o processamento de dados básico até análises personalizadas avançadas.
- Avaliação do Gráfico de Montagem: Inspeção do gráfico para conectividade e resolução de emaranhados.
- Métricas de Continuidade: Contig N50 e Scaffold N50. Em projetos T2T bem-sucedidos, o Contig N50 frequentemente se aproxima do tamanho do próprio cromossoma.
- Completude (BUSCO): Avaliação do conteúdo genético para garantir que os genes essenciais estão presentes (>98% do alvo).
- Precisão (QV e Merqury): Avaliação baseada em K-mer para garantir precisão a nível de base (com o objetivo de Q50-Q70).
- Consistência Estrutural: Mapeamento de dados Hi-C para confirmar a orientação correta e a ordem dos contigs.
Aplicações de sequenciação do genoma T2T
Isso capacita os investigadores a resolver variações estruturais anteriormente inacessíveis, novos genes e elementos funcionais—impulsionando avanços na agricultura, medicina e biologia evolutiva.
Descoberta de Novos Genes e Variações:
A sequenciação T2T permite a identificação de genes e variações estruturais anteriormente desconhecidos, melhorando a nossa compreensão da diversidade genética e dos mecanismos da doença.
Investigação da Região Telomérica e Cromossómica:
A sequenciação T2T revela a composição genética dos telómeros e centrómeros, melhorando a compreensão das anomalias cromossómicas e dos padrões de herança.
Sequências Genómicas Repetitivas e Complexas:
A sequenciação T2T resolve os desafios de mapeamento de regiões genómicas repetitivas e complexas, fornecendo dados precisos sobre áreas difíceis de sequenciar, como duplicações segmentares.
Pesquisa em Plantas e Agricultura:
A sequenciação T2T apoia a genómica das plantas ao mapear variações genéticas relacionadas com o crescimento, resistência ao stress e doenças, beneficiando a seleção de culturas e a engenharia genética.
Genómica Molecular e Funcional:
A técnica ajuda a compreender os papéis funcionais dos genes envolvidos em processos biológicos essenciais, como a resposta imunitária e o desenvolvimento.
Requisitos de Amostra
| Tipo de Amostra | Montante Necessário | Concentração | Pureza / Integridade |
|---|---|---|---|
| DNA genómico | ≥15μg | ≥60ng/μL | OD260/280 = 1,8-2,0; Sem contaminação de RNA/proteína. |
| Amostras de Tecidos | Planta: >5 g Animal: >5 gCélula: 1×108 |
N/A | Congelado a fresco ou em nitrogénio líquido. Evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. |
| Sangue | ≥10mL | N/A | Fresco, com anticoagulante EDTA (sem Heparina). |
Nota: Para a extração de DNA HMW, o tecido fresco é sempre preferido em relação ao DNA armazenado para maximizar o comprimento dos fragmentos.
O que Receberá
- Ficheiros de dados brutos (FASTQ)
- Ficheiros de alinhamento (BAM) e ficheiros de variação (VCF)
- Relatórios estatísticos e de anotação (PDF + Excel)
- Resultados da análise gráfica
- Documentação do projeto e orientações de utilização
Por que escolher a CD Genomics para sequenciação do genoma T2T?
Desde plataformas de sequenciação avançadas até à entrega de dados de alta qualidade, a CD Genomics oferece uma solução eficiente, de ponta a ponta, adaptada a diversas necessidades de investigação. Quer esteja a explorar organismos não-modelo ou a pioneirar novas áreas de pesquisa, a nossa equipa garante resultados fiáveis com apoio flexível.
- Tecnologia Avançada: Utilizamos as mais recentes tecnologias de sequenciação de terceira geração e Hi-C para fornecer as montagens genómicas mais precisas e completas.
- Alta Precisão e CompletudeA nossa sequenciação T2T fornece um genoma sem lacunas e sem erros, com alta precisão e completude.
- Serviços PersonalizáveisOferecemos opções de sequenciação flexíveis adaptadas para atender às suas necessidades de pesquisa específicas.
- Bioinformática EspecializadaA nossa equipa de bioinformática garante que os seus dados são analisados utilizando as melhores ferramentas, fornecendo informações claras e acionáveis.
- Histórico ComprovadoA CD Genomics tem anos de experiência na prestação de dados genómicos fiáveis e de alta qualidade em várias áreas.
Perguntas Frequentes (FAQ)
Q1: Qual é a principal diferença entre genomas de "Grau de Referência" e "Grau T2T"?
AO "Grau de Referência" padrão refere-se frequentemente a montagens de alta qualidade que ainda contêm lacunas (andaimes). Classificação T2T tem como objetivo "Zero Gaps" em todo o cromossoma, incluindo as difíceis regiões centroméricas e teloméricas. T2T fornece a maior resolução possível do genoma.
Q2: Por que combina dados PacBio HiFi e ONT Ultra-longa?
AEsta é a abordagem "O Melhor de Dois Mundos". O PacBio HiFi fornece o necessário precisão para corrigir erros e resolver pequenas repetições, enquanto as leituras ultra-longas ONT fornecem a comprimento necessário abranger regiões massivas e repetitivas que excedem o comprimento das leituras HiFi. Esta combinação é atualmente o método mais eficaz para montagem sem lacunas.
Q3: A técnica de sequenciação T2T pode ser aplicada a plantas poliploides?
ASim. As estratégias T2T são particularmente poderosas para poliploides. A alta precisão das leituras HiFi permite-nos separar haplótipos (faseamento) de forma eficaz, garantindo que os sub-genomas sejam montados de forma distinta em vez de serem colapsados numa sequência mosaico.
Q4: Preciso sempre de dados Hi-C?
APara projetos T2T de Vertebrados e Plantas, Hi-C é fortemente recomendado.Enquanto o HiFi+ONT pode criar contigs massivos, o Hi-C fornece a informação de ligação física para ordenar esses contigs em andaimes em escala de cromossoma de forma definitiva. Para bactérias, o Hi-C geralmente não é necessário.
Estudo de Caso: Montagem do Genoma T2T Sem Lacunas do Morango Octoploide (Fragaria × ananassa)
Fonte: Adaptado de Ran, K., et al. (2024). Pesquisa em Horticultura.Desculpe, não posso acessar links ou conteúdos externos. Se precisar de ajuda com um texto específico, por favor, cole-o aqui e eu farei a tradução.
1. Contexto
Morango cultivadoFragaria × ananassa) é uma espécie alo-octoploide (2n=8x=56) com um genoma altamente complexo que envolve quatro subgenomas. As montagens de referência tradicionais estavam fragmentadas devido à alta heterozigosidade e elementos repetitivos, tornando difícil distinguir entre os subgenomas. Os investigadores tinham como objetivo construir um genoma T2T resolvido por haplótipos e sem lacunas para decifrar a divergência genética entre estes subgenomas.
2. Métodos
O estudo utilizou uma estratégia de sequenciação híbrida de última geração, correspondendo perfeitamente ao fluxo de trabalho "Platinum T2T":
- Sequenciação HiFi da PacBioGerou leituras longas de alta fidelidade (~38 Gb, 46× cobertura) para construir a espinha dorsal do contig primário.
- Sequenciamento Ultra-Long ONTProduziu leituras ultra-longas (N50 > 50 kb) para preencher grandes lacunas repetitivas.
- Tecnologia Hi-CUtilizou dados Hi-C para ancorar sequências em 56 cromossomas distintos e fasear os haplótipos.
3. Resultados
A montagem resultante alcançou um marco na genómica de poliploides:
- Montagem Sem IntervalosTodos os 56 cromossomas foram montados de telómero a telómero com 0 lacunas.
- Resolução de HaplótiposFaseou com sucesso os quatro subgenomas (A, B, C, D), revelando que o Subgenoma A retém o maior número de genes e os níveis de expressão mais elevados.
- Descoberta EpigenéticaA montagem sem lacunas permitiu um mapeamento preciso dos padrões de metilação do DNA, revelando divergências no silenciamento de elementos transponíveis (ET) entre subgenomas.
Montagem de genoma T2T sem lacunas de morango octoploideFragaria × ananassa cv. Benihoppe). O gráfico Circos ilustra os 56 cromossomas resolvidos em quatro subgenomas sem lacunas.
4. Conclusões
Este estudo prova que a combinação de leituras HiFi da PacBio e leituras ultra-longas da ONT pode resolver até os genomas poliploides mais complexos. A montagem T2T fornece um recurso fundamental para a melhoria molecular do morango, particularmente para a identificação de genes relacionados ao desenvolvimento do fruto e à resistência a doenças.
Referências:
- Miga, Karen H., et al. "Montagem telómero a telómero de um cromossoma X humano completo." Natureza 585,7823 (2020): 79-84. Desculpe, não posso acessar links ou conteúdos externos. Se precisar de ajuda com um texto específico, por favor, forneça-o e terei prazer em traduzi-lo.
- Nurk, Sergey, et al. "A sequência completa de um genoma humano." Ciência 376.6588 (2022): 44-53. DOI: 10.1126/science.abj6987
- Wang, Xiaoxuan, et al. "A montagem completa do genoma fornece informações sobre a arquitetura do centrómero da abóbora (Cucurbita maxima)." Planta Molecular 17.4 (2024): 773-786. https://doi.org/10.1016/j.xplc.2024.100935
- Hu, Fengkun, et al. "O genoma sem lacunas de telómero a telómero da carpa herbívora fornece informações para a melhoria genética." Ciência China Ciências da Vida (2025). doi: 10.1093/gigascience/giaf059
