Q1: What is nanopore targeted sequencing and how does it differ from whole-genome sequencing?

Nanopore targeted sequencing focuses on specific genomic regions of interest—such as genes, hotspots, or structural variant breakpoints—rather than sequencing the entire genome. This approach enables higher coverage of those targets, less data waste, and retention of long reads and epigenetic modifications. Whole-genome sequencing provides comprehensive coverage but is more costly and generates more data than needed for focused studies.

Q2: What are the different methods or routes to do targeted sequencing with nanopore technology?

There are several approaches: (1) PCR-based amplicon sequencing for well-defined small targets; (2) probe or hybrid capture panels (less common in nanopore but available via custom or third-party designs); (3) CRISPR-Cas9 enrichment, which is amplification-free and suited for structural variants and difficult genomic regions; and (4) adaptive sampling, which enriches or depletes reads in real time using software without additional wet-lab steps.

Q3: What is the difference between nanopore amplicon sequencing and other targeted sequencing methods?

Amplicon sequencing is PCR-based, cost-effective, and rapid, but it may introduce amplification bias, miss GC-rich or repetitive regions, and remove methylation information. Cas9 enrichment or adaptive sampling avoids PCR, preserves methylation, and captures structural complexity across long genomic regions.

Q4: How does nanopore Cas9 targeted sequencing compare with hybrid capture?

Cas9 enrichment is faster, simpler, and probe-free, producing long reads that resolve repeats and structural variants better. Hybrid capture is useful for broad panels, but requires probe design, more steps, and may not capture complex structural contexts as effectively.

Q5: Can nanopore targeted sequencing detect epigenetic modifications such as DNA methylation?

Yes. When using amplification-free methods like Cas9 enrichment or adaptive sampling, nanopore sequencing directly detects base modifications, including methylation, without additional chemical treatments or library preparation.

Q6: Can adaptive sampling be applied to low-input or degraded DNA?

Yes, adaptive sampling works with standard nanopore libraries. For highly fragmented or low-input DNA, such as FFPE or ancient samples, modified protocols can help improve performance, although enrichment efficiency depends on fragment size and quality.

Q7: What are the limitations or trade-offs of nanopore targeted sequencing compared to short-read or PCR-based methods?

Nanopore sequencing may have lower single-read accuracy than short-read platforms, though coverage and consensus improve results. Amplicon methods can suffer from PCR bias, while adaptive sampling efficiency depends on target size and DNA length. In contrast, nanopore sequencing delivers long reads, preserves methylation, and resolves structural variants and repeats that short-read or PCR-only approaches cannot.

Q8: What sample quality and input are required for reliable targeted sequencing results?

High molecular weight DNA is preferred, with minimal degradation, proper purity ratios (OD 260/280 ~1.8; OD 260/230 ~2.0–2.2), and sufficient concentration. Amplicon sequencing tolerates smaller or more fragmented inputs, while Cas9 enrichment and adaptive sampling perform best with longer DNA fragments and high-quality preparations.

Q9: Which nanopore device should I choose for targeted sequencing projects?

Device selection depends on scale and complexity. MinION is suitable for small panels or individual targets, while GridION or PromethION are recommended for larger panels, multiple samples, or projects requiring higher throughput. Multiplexing options, flow cell type, and read length goals also influence device choice.

Q10: How is adaptive sampling set up and what does it do for targeted sequencing?

Adaptive sampling is configured in MinKNOW by providing reference files and optional BED coordinates for target regions. During sequencing, software evaluates read starts in real time, allowing on-target reads to continue while rejecting off-target reads to free pores. This provides enrichment or depletion without extra wet-lab enrichment, with effectiveness depending on target size and input DNA quality.

Q11: How many variants can be detected reliably with nanopore targeted sequencing?

Nanopore targeted sequencing can detect SNVs, small indels, structural variants such as large deletions or inversions, repeat expansions if reads span them, and haplotypes when coverage and read length allow. Sensitivity and specificity depend on target design, sequencing depth, and DNA quality.

Q12: What bioinformatics deliverables are included in a standard project?

Typical deliverables include raw reads (FASTQ), alignments (BAM), variant calls (VCF for SNVs, indels, SVs), coverage and enrichment statistics, optional methylation or base modification files, and graphical summaries such as variant maps or structural variant plots. Annotation reports linking results to genes, known variants, or pathways are also provided.

Serviço de Sequenciação Alvo por Nanoporos | Rápido, Flexível, Preciso

Índice

Introdução ao Sequenciamento Direcionado por Nanoporos

Sequenciação Alvo por Nanoporos permite que os investigadores concentrem o esforço de sequenciação nas partes mais relevantes do genoma—sejam genes específicos, regiões com alta significância biológica ou táxons microbianos raros—evitando a sequenciação desnecessária de DNA de fundo.

Ao contrário dos métodos tradicionais que requerem Amplificação por PCR ou captura por hibridizaçãoa tecnologia de nanoporo oferece estratégias flexíveis para realizar sequenciação direcionada:

Abordagens baseadas em amplicões de nanopore para a caracterização económica de produtos de PCR

Sequenciação direcionada por Cas9 para enriquecimento preciso de genes relacionados com doenças ou resistência a antimicrobianos (AMR)

Amostragem adaptativaum método único baseado em software, que enriquece ou depleta fragmentos de ADN durante a sequenciação sem quaisquer etapas laboratoriais adicionais

Esta flexibilidade torna sequenciação direcionada por nanopore particularmente poderoso para aplicações em oncologia, microbiologia, epigenética e estudos evolutivos.

Por que escolher o sequenciamento direcionado por nanopore?

Sequenciação Longa e Sem Viés

A sequenciação por nanopore suporta qualquer comprimento de leitura a partir de 50 pb para >4 Mb, proporcionando a capacidade de abranger grandes variantes estruturais, elementos repetitivos e regiões ricas em GC que os métodos de leitura curta não conseguem resolver.

Preservar Informação Epigenética

Ao contrário do enriquecimento baseado em PCR ou sondas, a sequenciação direcionada por nanopore analisa diretamente moléculas nativas de DNA e RNA, mantendo os sinais de metilação e modificação de bases essenciais para a investigação regulatória e do câncer.

Enriquecimento em Tempo Real

A amostragem adaptativa permite que os investigadores monitorem a saída de dados durante a execução, enriquecendo ou esgotando leituras de interesse em tempo real. Isso reduz o tempo de resposta e garante um uso eficiente da capacidade de sequenciação.

Fluxos de Trabalho Flexíveis e Rentáveis

Sem necessidade de painéis de captura caros ou otimização extensiva, o sequenciamento direcionado por nanoporo oferece um caminho mais rápido e escalável para resultados em comparação com os métodos tradicionais.

Recurso	Captura Direcionada por Nanoporos	Genoma Completo de Nanoporos	Captura Direcionada Illumina
Comprimento de Leitura	Leituras longas	Leituras longas	Leituras curtas
Variação	Variações estruturais complexas modificações epigenéticas	variações do genoma completo modificações epigenéticas	SNVs/Indels
Sequenciação em Tempo Real	Sim	Sim	Não
Viés de Amplificação	Não	Não	Sim
Portabilidade	Alto	Alto	Baixo
Rendimento	Moderado	Moderado	Alto
Custo	Moderado	Alto	Moderado

Os Nossos Pacotes de Serviços de Sequenciamento Direcionado por Nanopore

Na CD Genomics, oferecemos pacotes de serviços cuidadosamente elaborados para Sequenciação Direcionada por Nanoporos para atender a diversas necessidades de pesquisa. Cada pacote está sob o âmbito do sequenciamento direcionado — selecionando regiões genómicas específicas de interesse — mas difere em métodos, requisitos de entrada e dados entregues. Revise as opções abaixo e selecione o pacote que melhor se alinha com os objetivos do seu projeto, qualidade da amostra e orçamento.

Nome do Pacote	Melhor Para / Casos de Uso	Requisitos de Entrada e Amostra	O que está incluído	Vantagens
Pacote Básico de Amplicon	Projetos focados em mutações específicas de hotspots, pequenos painéis genéticos, codificação 16S / ITS, identificação de marcadores microbianos.	DNA ≥ 50–100 ng; tamanho de fragmento aceitável ≥ ~500-1000 bp; alvos bem conhecidos; número moderado de loci	Design de primers para PCR; amplificação por PCR; sequenciação por nanopore de amplicons; chamada de SNV / pequenas inserções e deleções; relatório básico de QC.	Custo baixo; rápida execução; bem adequado para laboratórios com material de amostra limitado; alta profundidade sobre poucos alvos.
Pacote Deep-Target Cas9 / Painel	Painéis genéticos de médio a grande porte; deteção de variantes estruturais; regiões desafiadoras ou repetitivas; preservação de características de metilação e epigenéticas.	DNA de alta qualidade (≥ 200-500 ng), tamanho de fragmento longo preferido (>10-20 kb); degradação mínima; pureza da amostra suficiente.	Design de RNA guia; enriquecimento mediado por Cas9; sequenciação de nanopore de leitura longa; chamada de SNV + SV; perfilagem de metilação opcional; relatório detalhado.	Alvo sem sonda de regiões difíceis; mantém modificações nativas do DNA; capaz de detectar grandes inserções / deleções e elementos móveis.
Pacote de Amostragem Adaptativa	Projetos que necessitam de flexibilidade: alteração de coordenadas-alvo em tempo real; depleção de ADN hospedeiro / de fundo; alvos raros em amostras mistas.	DNA genómico de boa qualidade; a quantidade varia de acordo com o tamanho do alvo; a necessidade de entrada depende da proporção do genoma alvo; arquivo BED com as coordenadas do alvo fornecido.	Configuração de amostragem adaptativa no MinKNOW; sequenciação com enriquecimento ou depleção no dispositivo; monitorização em tempo real; análise de SNV, SV, modificação de bases; estatísticas de QC e cobertura.	Sem enriquecimento adicional em laboratório húmido; configuração rápida; direcionamento dinâmico; bom para amostras ambientais ou metagenómicas com problemas de ADN de fundo.
Painel Abrangente + Multi-Ómicas Pacote	Testar muitos genes (por exemplo, painéis de câncer hereditário), integrando dados de mutação, estrutura, metilação e haplótipos; grandes estudos que requerem um conjunto completo de características.	Entrada elevada (≥ ~500 ng–1 µg dependendo dos alvos); alta integridade do DNA; fragmentos longos fortemente desejáveis; controlo de qualidade da amostra necessário.	Enriquecimento de painel completo (via Cas9 ou designs de sondas híbridas); dados de leitura longa; chamada de SNV / SV / indels; metilação de DNA / modificações epigenéticas; faseamento de haplótipos; QC completo / anotação; relatórios abrangentes.	Dados ricos em um experimento; cobre todos os tipos de variantes + marcas epigenéticas; útil para genética de doenças em profundidade, mapeamento de traços, genómica funcional.

Qual Pacote Deverá Escolher?

Se os seus alvos são poucos, bem caracterizados, e precisa de resultados rápidos → o Pacote Básico de Amplicão será frequentemente suficiente.
Se variantes estruturais, repetições ou regiões genómicas difíceis forem importantes, escolha o pacote Cas9 / Painel Deep-Target ou o Painel Abrangente + Multi-Omics.
Se a amostra estiver misturada / o DNA de fundo for elevado / espera-se ajustar os alvos → A Amostragem Adaptativa oferece mais flexibilidade.
Para projetos que requerem todas as camadas de informação (mutações + estrutura + metilação + haplótipos), o Pacote Abrangente oferece o conjunto de dados mais completo.

Aplicações da Sequenciação Direcionada por Nanoporos

Genómica do Cancro

Detetar variantes estruturais, como grandes inserções, deleções e inversões, com resolução de ponto de ruptura.
Perfil de modificações epigenéticas (por exemplo, hipermetilação do promotor do MLH1 na investigação da síndrome de Lynch)
Apoio a painéis de risco de cancro hereditário com mais de 250 genes, incluindo BRCA1/2.
Ative o agrupamento de haplótipos para avaliação de risco específica de alelos.

Resistência Antimicrobiana (RAM)

Rastrear ARGs como blaCTX-M e blaTEM com Context-seq
Colocar os genes de resistência no seu contexto genómico (plasmídeos, transposões)
Estudar a transmissão interespécies de ARGs entre humanos, animais e ambiente.

Microbioma e Metagenómica

Remover o DNA do hospedeiro para enriquecer genomas microbianos
Enriquecer táxons raros ou genes funcionais (nifH, amoA, ARGs) para estudos ecológicos
Montar genomas microbianos quase completos a partir de espécies de baixa abundância.

Epigenética e Regulação Genética

Promotores, potenciadores ou regiões de impressão para perfilagem direta de metilação
Estudar elementos repetidos como o LINE-1 para compreender a estabilidade do genoma.
Mapear padrões de metilação específicos de alelos no câncer ou na biologia do desenvolvimento.

DNA Antigo e Medicina Forense

Maximizar o uso de amostras degradadas ou limitadas
Enriquecer genomas mitocondriais, loci de determinação do sexo ou marcadores de espécies

Biologia Sintética

Verificar cromossomas artificiais, vias engenheiradas ou edições CRISPR
Alvo grandes construções para confirmar a integridade e os pontos de inserção.

O nosso Fluxo de Trabalho de Sequenciação Direcionada por Nanopore

Submissão de amostras e controlo de qualidade

Aceitar sangue, tecidos, células, amostras microbianas e ADN antigo.
QC de ADN: verificações de pureza, integridade e concentração.

Preparação da biblioteca

Protocolos de amplificação, baseados em Cas9, ou protocolos de ligadura padrão.

Execução de sequenciação por nanopore

Throughput escalável no GridION ou PromethION.

Monitorização em tempo real e amostragem adaptativa

Seleção no dispositivo para esgotamento de alvos ou anfitriões.

Análise bioinformática

Chamadas de SNV/Indel, deteção de SV, análise de metilação, faseamento de haplótipos.

Entrega de relatório

Conjunto de dados abrangente, variantes anotadas e resultados prontos para publicação.

Nanopore targeted sequencing workflow with Cas9 targeting, adaptive sampling, and bioinformatics analysis Fluxo de trabalho de sequenciação direcionada por Nanopore da CD Genomics, desde a extração de DNA e definição de alvos até enriquecimento, sequenciação de longas leituras e relatórios de bioinformática..

Análise Bioinformática de Sequenciação Alvo por Nanoporos

Entregáveis

Ficheiros de sequenciação bruta (FASTQ)
Alinhamento (BAM) e chamadas de variantes (VCF)
Estatísticas de cobertura/enriquecimento
Relatórios anotados com SNVs, SVs, metilação (PDF + Excel)
Sumários gráficos (gráficos circos, mapas de variantes, trilhos de metilação)

Por que fazer parceria com a CD Genomics?

Anos de experiência em sequenciação genómica através das plataformas Illumina, PacBio e Nanopore

fiabilidade de grau CRO, confiável por empresas farmacêuticas, biotecnológicas e instituições académicas

Design de projeto flexível: de alvos únicos a painéis genéticos completos para o câncer

Apoio bioinformático abrangenteanotação de variantes, mapeamento de metilação, rastreamento de genes de resistência a antimicrobianos

Serviço de ponta a ponta: amostragem de QC, sequenciação, análise de dados, entrega de portal de dados seguro

Requisitos de Amostra

Tipos e Entradas de Amostras Aceitáveis

Tipo de Amostra	Quantidade/Entrada Recomendada	Quantidade/Entrada Mínima	Concentração Mínima / Pureza	Notas sobre Integridade / Manuseio
DNA Genómico de Alto Peso Molecular	≥ 5 µg no total, concentração ≥ 20-50 ng/µL	≥ 3 µg	OD 260/280 ≈ 1.8; OD 260/230 ≈ 2.0-2.2; tratado com RNase; livre de contaminação visível por proteínas, fenol e detergentes.	Tamanho médio do fragmento grande (idealmente ≥ 30 kb); degradação mínima; armazenado em um tampão como 10 mM Tris pH 8.0-8.4; enviado a frio (com pacotes de gelo ou gelo seco)
DNA Microbiana / Ambiental	≥ 500 ng	≥ 300-500 ng	≥ ~10 ng/µL; alta pureza (sem inibidores)	Se a amostra incluir hospedeiros ou contaminantes, considere a depleção do hospedeiro ou a escolha de caminhos de amostragem adaptativos; devidamente congelada ou estabilizada durante o transporte.
Amostras de Tecidos ou Células	Quantidade suficiente para produzir DNA de alto peso molecular (tipicamente ≥ alguns µg)	O mais alto possível; amostras degradadas ou de baixo rendimento podem comprometer leituras longas.	Pureza igual à acima; DNA livre de contaminantes de RNA / proteínas; degradação mínima do DNA	Preferencialmente fresco ou congelado rapidamente; evitar congelar e descongelar repetidamente; para tecidos, fatias mais finas ajudam; armazenamento e transporte em gelo seco ou gelo azul.

Condições de Armazenamento, Buffer e Envio

O DNA pode estar em água livre de RNase, tampão TE ou 10 mM Tris (pH 8.0-8.4). Evite tampões com detergentes, surfactantes ou EDTA em altas concentrações que possam interferir nas etapas subsequentes.
Para DNA em tampão aquoso ou Tris/TE, envie com pacotes de gelo ou gelo seco para manter frio. Para DNA armazenado em 70% de etanol, o envio à temperatura ambiente pode ser aceitável.
Rotule os tubos de amostra de forma clara: use marcador permanente; rotule tanto o topo como o lado; os nomes das amostras nos tubos devem corresponder aos do formulário de submissão. Utilize tubos robustos (1,5 mL recomendado) ou placas com tampas seladas; proteja contra quebras.
Métricas de Controlo de Qualidade
Pureza: OD260/280 próximo de ~1.8; OD260/230 em torno de 2.0-2.2. Integridade do DNA: degradação mínima; avaliação visual em gel ou por campo pulsado ou equivalente; alto peso molecular (distribuição de tamanho inclinada para fragmentos longos).
Concentração: medida preferencialmente por métodos fluorescentes (por exemplo, Qubit) em vez de apenas por absorção UV; garantir entrada suficiente para o pacote escolhido.

Formulário de Submissão, Rotulagem e Documentação

Preencha o Formulário de Submissão de Amostras, listando o ID da amostra, tipo de amostra, quantificação e métricas de QC. O ID da amostra no formulário deve corresponder exatamente ao rótulo no tubo.
Submeter a versão eletrónica dos dados de QC (por exemplo, concentração, razões de OD, perfil de tamanho de fragmentos) juntamente com amostras físicas.

Demonstração de Resultados

Melhoria da Resolução Taxonómica

Nanopore targeted amplicon sequencing improves species-level taxonomic resolution

Comparação da resolução de classificação microbiana entre sequenciação de amplicões de leitura curta e sequenciação de amplicões de leitura longa por nanopore.

Precisão de Consenso com Supressão de Erros

O polimento de consenso melhora a precisão da deteção de variantes em sequenciação direcionada por nanopore.

Consensus accuracy in nanopore targeted sequencing variant detection

Análise da Diversidade da Comunidade

Adaptive sampling improves microbial diversity detection in nanopore targeted sequencing

A amostragem adaptativa melhora a deteção de táxons microbianos raros ao esgotar o fundo de ADN do hospedeiro..

Resolução de Variantes Estruturais e Repetições

Cas9 targeted nanopore sequencing resolves structural variants and repeat expansions

O enriquecimento direcionado por Cas9 revela variantes estruturais e expansões de repetições com resolução de pontos de ruptura..

Insights Epigenéticos do DNA Nativo

Nanopore targeted sequencing detects DNA methylation and epigenetic modifications

Deteção direta da metilação de DNA durante o sequenciamento direcionado por nanopore de DNA nativo.

Perguntas Frequentes (FAQ)

Q1: O que é sequenciação direcionada por nanopores e como se diferencia da sequenciação do genoma completo?

A sequenciação direcionada por nanopore foca em regiões genómicas específicas de interesse—como genes, hotspots ou pontos de quebra de variantes estruturais—em vez de sequenciar todo o genoma. Esta abordagem permite uma maior cobertura desses alvos, menos desperdício de dados e a retenção de leituras longas e modificações epigenéticas. A sequenciação de todo o genoma proporciona uma cobertura abrangente, mas é mais cara e gera mais dados do que o necessário para estudos focados.

Q2: Quais são os diferentes métodos ou "rotas" para realizar sequenciação direcionada com tecnologia de nanopore?

Existem várias abordagens: (1) sequenciação de amplicões baseada em PCR para alvos pequenos bem definidos; (2) painéis de sondas ou captura híbrida (menos comuns em nanopore, mas disponíveis através de designs personalizados ou de terceiros); (3) enriquecimento CRISPR-Cas9, que é livre de amplificação e adequado para variantes estruturais e regiões genómicas difíceis; e (4) amostragem adaptativa, que enriquece ou depleta leituras em tempo real usando software sem etapas adicionais de laboratório molhado.

Q3: Qual é a diferença entre a sequenciação de amplicões por nanoporo e outros métodos de sequenciação direcionada?

A sequenciação de amplicões é baseada em PCR, é económica e rápida, mas pode introduzir viés de amplificação, perder regiões ricas em GC ou repetitivas e remover informações de metilação. O enriquecimento com Cas9 ou a amostragem adaptativa evita a PCR, preserva a metilação e captura a complexidade estrutural em longas regiões genómicas.

Q4: Como é que a sequenciação direcionada por nanopore Cas9 se compara com a captura híbrida?

A enriquecimento com Cas9 é mais rápido, simples e livre de sondas, produzindo leituras longas que resolvem repetições e variantes estruturais de forma mais eficaz. A captura híbrida é útil para painéis amplos, mas requer o design de sondas, mais etapas e pode não capturar contextos estruturais complexos de forma tão eficaz.

Q5: A sequenciação direcionada por nanoporo pode detectar modificações epigenéticas como a metilação do DNA?

Sim. Ao utilizar métodos sem amplificação, como o enriquecimento por Cas9 ou amostragem adaptativa, o sequenciamento por nanopore deteta diretamente modificações de bases, incluindo a metilação, sem tratamentos químicos adicionais ou preparação de bibliotecas.

Q6: Pode a amostragem adaptativa ser aplicada a DNA de baixo input ou degradado?

Sim, a amostragem adaptativa funciona com bibliotecas de nanoporos padrão. Para DNA altamente fragmentado ou de baixo input, como amostras FFPE ou antigas, protocolos modificados podem ajudar a melhorar o desempenho, embora a eficiência de enriquecimento dependa do tamanho e da qualidade dos fragmentos.

Q7: Quais são as limitações ou compensações do sequenciamento direcionado por nanopore em comparação com métodos de leitura curta ou baseados em PCR?

A sequenciação por nanopore pode ter uma precisão de leitura única inferior à das plataformas de leitura curta, embora a cobertura e o consenso melhorem os resultados. Os métodos de amplicão podem sofrer de viés de PCR, enquanto a eficiência da amostragem adaptativa depende do tamanho do alvo e do comprimento do DNA. Em contraste, a sequenciação por nanopore fornece leituras longas, preserva a metilação e resolve variantes estruturais e repetições que abordagens de leitura curta ou apenas PCR não conseguem.

Q8: Que qualidade de amostra e entrada são necessárias para resultados de sequenciação direcionada fiáveis?

O DNA de alto peso molecular é preferido, com degradação mínima, razões de pureza adequadas (OD 260/280 ~1,8; OD 260/230 ~2,0–2,2) e concentração suficiente. O sequenciamento de amplicons tolera entradas menores ou mais fragmentadas, enquanto o enriquecimento com Cas9 e a amostragem adaptativa funcionam melhor com fragmentos de DNA mais longos e preparações de alta qualidade.

Q9: Qual dispositivo de nanoporo devo escolher para projetos de sequenciação direcionada?

A seleção do dispositivo depende da escala e complexidade. O MinION é adequado para painéis pequenos ou alvos individuais, enquanto o GridION ou PromethION são recomendados para painéis maiores, múltiplas amostras ou projetos que exigem maior capacidade de processamento. As opções de multiplexação, o tipo de célula de fluxo e os objetivos de comprimento de leitura também influenciam a escolha do dispositivo.

Q10: Como é que a amostragem adaptativa é configurada e o que faz pela sequenciação direcionada?

A amostragem adaptativa é configurada no MinKNOW fornecendo ficheiros de referência e coordenadas BED opcionais para regiões-alvo. Durante a sequenciação, o software avalia os inícios das leituras em tempo real, permitindo que as leituras-alvo continuem enquanto rejeita as leituras fora do alvo para libertar poros. Isso proporciona enriquecimento ou depleção sem enriquecimento adicional em laboratório, com a eficácia dependendo do tamanho do alvo e da qualidade do DNA de entrada.

Q11: Quantas variantes podem ser detetadas de forma fiável com sequenciação direcionada por nanopore?

O sequenciamento direcionado por nanopore pode detectar SNVs, pequenas indels, variantes estruturais como grandes deleções ou inversões, expansões de repetições se as leituras as abrangerem, e haplótipos quando a cobertura e o comprimento das leituras o permitirem. A sensibilidade e a especificidade dependem do design do alvo, da profundidade de sequenciamento e da qualidade do DNA.

Q12: Quais são os entregáveis de bioinformática incluídos em um projeto padrão?

Os entregáveis típicos incluem leituras brutas (FASTQ), alinhamentos (BAM), chamadas de variantes (VCF para SNVs, indels, SVs), estatísticas de cobertura e enriquecimento, arquivos opcionais de metilação ou modificação de bases, e resumos gráficos como mapas de variantes ou gráficos de variantes estruturais. Também são fornecidos relatórios de anotação que ligam os resultados a genes, variantes conhecidas ou vias metabólicas.

Estudo de Caso: Sequenciação de próxima geração direcionada baseada em nanoporos de amostras de tecido para diagnóstico de tuberculose (Gao, Yang, Wang, Guo & Zeng et al., 2024)

FonteWeiwei Gao, Chen Yang, Tianzhen Wang, Yicheng Guo, Yi Zeng (2024). Sequenciação de próxima geração direcionada baseada em nanopores de amostras de tecido para diagnóstico de tuberculose. Fronteiras em Microbiologia 15:1403619. DOI: 10.3389/fmicb.2024.1403619.

1. Contexto

O diagnóstico de tuberculose (TB) em tecido (TB extrapulmonar, EPTB) é difícil quando o escarro não está disponível. Métodos tradicionais (coloração HE + AFB, HE + PCR, HE + IHC, Xpert MTB/RIF) frequentemente apresentam baixa sensibilidade com amostras de tecido. Este estudo investiga se a sequenciação de próxima geração (tNGS) baseada em nanoporo pode melhorar a sensibilidade e especificidade do diagnóstico em amostras de tecido, incluindo a deteção de potencial resistência a fármacos.

2. Métodos

Um total de 110 amostras clínicas de tecido foram recolhidas.
O ensaio tNGS teve como alvo o Mycobacterium tuberculosis. Foi comparado com coloração HE + AFB, HE + PCR, HE + imuno-histoquímica (IHC com anti-MPT64) e Xpert MTB/RIF.
Também foi incluída a deteção de resistência a medicamentos em pacientes cujas amostras mostraram positividade.

3. Resultados

tNGS alcançou uma sensibilidade de 88,2% e uma especificidade de 94,1% em amostras de tecido.
Os métodos comparadores apresentaram uma sensibilidade notavelmente mais baixa: HE + AFB (30,1%), HE + PCR (49,5%), HE + IHC (47,3%), Xpert MTB/RIF (59,1%). As especificidades dos comparadores variaram entre ~82-94%.
Análise da resistência a medicamentos: de 93 pacientes com tuberculose positiva, 10 (≈10,75%) apresentaram resistência potencial a medicamentos identificada por tNGS.

Nanopore full-length lncRNA sequencing case study – MdLNC610 regulates apple anthocyanin via ethylene biosynthesis Figura 1. Sensibilidade e especificidade do tNGS versus métodos de diagnóstico convencionais para TB em amostras de tecido (HE + AFB, HE + PCR, HE + IHC, Xpert MTB/RIF).

4. Conclusões

A tNGS por nanoporo em amostras de tecido apresenta um desempenho substancialmente melhor do que a histopatologia tradicional e métodos moleculares para diagnosticar a tuberculose, incluindo em tecidos extrapulmonares onde a carga bacteriana é baixa. Também fornece informações sobre resistência a medicamentos, tornando-se uma ferramenta valiosa para um diagnóstico rápido e preciso em ambientes clínicos. O estudo apoia a utilização da tNGS como um complemento aos diagnósticos existentes para a tuberculose.

Referências:

Gao W, Yang C, Wang T, Guo Y, Zeng Y. Sequenciação de próxima geração direcionada baseada em nanoporos de amostras de tecido para diagnóstico de tuberculose.Front Microbiol. 2024 Jul 3;15:1403619. doi: 10.3389/fmicb.2024.1403619. PMID: 39027106; PMCID: PMC11256091.
Yang C, Gao W, Guo Y, Zeng Y. Sequenciação de próxima geração (tNGS) baseada em nanopores: uma tecnologia versátil especializada na deteção de espécimes clínicos com baixa carga bacteriana.PLoS One. 27 de maio de 2025;20(5):e0324003. doi: 10.1371/journal.pone.0324003. PMID: 40424288; PMCID: PMC12111578.

Serviço de Sequenciação Direcionada por Nanoporos para Detetar SNVs, SVs e Epigenética