Sequenciação de Amplicões Absoluta Quantitativa 16s/18s/ITS

A Introdução à Sequenciação de Amplicões para Quantificação de Microrganismos

Sequenciação do gene 16S rRNA é comumente utilizado para identificação, classificação e quantificação de microrganismos dentro de misturas biológicas complexas. Em resumo, as regiões hipervariáveis do 16s rDNA em procariotos são amplificadas por PCR. Em seguida, os amplicons são sequenciados em sequenciação de alto rendimento plataforma. A análise de dados destas regiões hipervariáveis únicas é realizada para determinar a abundância relativa de cada táxon numa comunidade e para comparar o perfil taxonómico entre grupos de interesse. Este nível de análise pode ajudar a abordar as alterações no perfil microbiano global ao longo do tempo ou entre grupos de tratamento. Este método desempenha, assim, um papel crucial no estudo da composição e das mudanças dinâmicas dos microbiomas em amostras ambientais complexas.

Figura 1. As regiões e primers do 16S rRNA.

Recentemente, o problema da quantificação absoluta de um determinado grupo de microrganismos em uma amostra ambiental específica tem atraído cada vez mais atenção. No passado, era detectado pela quantificação absoluta de qPCR de espécies específicas, mas os resultados do qPCR são frequentemente instáveis, e primers específicos para qPCR de espécies específicas precisam ser desenhados e requerem uma maior especificidade de primers. Neste momento, o geral Sequenciação de rRNA 16S o método só pode obter dados de abundância relativa pela razão entre o número de sequências de um determinado OTU e o número total de sequências.

A genómica CD pode fornecer sequenciação de amplicões de quantificação de microrganismos com base em sequências de padrões externos de 16S para obter dados de abundância absoluta para espécies na amostra. A biblioteca de amplicões de 16S é construída e sequenciada adicionando uma sequência sintética de número de cópias conhecido ao DNA da amostra, e em seguida, é traçada uma curva padrão de acordo com o número de leituras de amplicões e o número absoluto de cópias da sequência padrão externa. E, finalmente, é calculado o número absoluto de cópias do gene 16S rRNA da espécie correspondente à sequência representativa do OTU na amostra.

Vantagens da Sequenciação de Amplicões Quantitativa Absoluta 16s/18s/ITS

• A implementação prática é mais simplificada, com maior rendimento e uma aplicabilidade mais ampla;
• Pode reduzir efetivamente o impacto de fatores como a amplificação por PCR e o sequenciamento na análise quantitativa de comunidades bacterianas dentro das amostras;
• Pode refletir com precisão a composição exata das comunidades bacterianas dentro das amostras, fornecendo referências de dados mais precisas para a investigação.

Aplicação de Sequenciação de Amplicões Quantitativa Absoluta 16s/18s/ITS

A sequenciação de amplicões 16S quantitativa absoluta oferece um meio mais preciso de rastrear a verdadeira composição das comunidades microbianas dentro das amostras. A sua aplicação vai além dos métodos de deteção convencionais, abrangendo diversos aspetos como:

• distribuição e dinâmica bacteriana,
• metabolismo funcional,
• assim como insights ecológicos e evolutivos sobre populações bacterianas.

Fluxo de Trabalho de Sequenciação de Amplicões Absoluta Quantitativa 16s/18s/ITS

O processo analítico começa com a recolha de amostras e a extração de ADN microbiano, seguido pela construção de bibliotecas que amplificam regiões alvo como os genes 16S/18S rRNA ou regiões ITS, levando à formação de bibliotecas de sequenciação. Após isso, é realizada a sequenciação de alto rendimento dos amplicons. A fase seguinte envolve uma análise de dados abrangente que inclui a verificação da qualidade dos dados de sequenciação, agrupamento de sequências ou desruído para a criação de OTUs ou ASVs, alocação taxonómica e quantificação precisa de espécies microbianas.

Especificações do Serviço

	Requisitos de Amostra Tipo de amostra: amostras de solo regulares e amostras de fezes, outros tipos de amostras precisam de ser avaliados. Solo ≥ 5 g; Fezes ≥ 2 g Quantidade de gDNA: > 500ng; concentração de gDNA ≥ 20ng/μL Nota: Os montantes de amostra são indicados apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.
Clique	Estratégia de Sequenciamento Região recomendada: V3/V4/V3+V4/V4+V5 MiSeq PE250/PE300, HiSeq PE150 ou MGI DNBSEQ-T7/DNBSEQ-G400 ≥ 15W leituras por amostra
	Análise Bioinformática Filtragem QC de dados de sequenciação Leituras a serem montadas, obter etiquetas únicas. Geração de OTUs e análise estatística Quantificação de OTUs Análise da composição de espécies Análise da diversidade alfa Análise da diversidade beta Estatísticas de diversidade …… Bioinformática avançada: Meta-análise Integração multi-ômica Algoritmos de agrupamento …… Nota: Os dados recomendados e os conteúdos de análise apresentados são apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes em Sequenciação de Amplicões Absoluta Quantitativa 16s/18s/ITS para a sua escrita (personalização)

Os resultados parciais estão mostrados abaixo:

A distribuição da taxonomia de todas as amostras no nível de classificação do Filo.

Mapa de calor da abundância de espécies.

Curva de rarefação das leituras sequenciadas para amostras (A figura acima) & A profundidade das amostras de sequenciação (A figura abaixo).

Análise de boxplot com base em bray Curtis (A), jaccard binário (B), unweighted unifrac (C) e weighted unifrac (D).

Análise PCoA baseada em bray Curtis (A), jaccard binário (B), unifrac não ponderado (C) e unifrac ponderado (D).

Árvore de agrupamento UPGMA.

Proporção média do grupo tratado e do grupo de controlo.

Cladograma.

PONTUAÇÃO LDA.

1. Como é que a Sequenciação de Amplicões Quantitativa Absoluta difere da sequenciação de amplicões tradicional?

Tradicional sequenciação de amplicões fornece dados de abundância relativa, que podem ser enganosos, uma vez que não contabilizam as variações na carga microbiana total entre amostras. A Sequenciação de Amplicões Quantitativa Absoluta utiliza padrões internos ou externos para fornecer contagens absolutas de táxons microbianos, oferecendo uma imagem mais precisa da estrutura da comunidade microbiana.

2. Que tipos de amostras são adequadas para análise utilizando Sequenciação de Amplicões Quantitativa Absoluta?

Esta metodologia é versátil e pode ser efetivamente aplicada a uma infinidade de tipos de amostras, incluindo solo, água, ar, tecidos humanos e animais, espécimes de plantas, bem como uma variedade de matrizes ambientais e industriais.

3. Qual é a unidade de medida para a quantificação absoluta na sequenciação de amplicões 16S?

A unidade de medida para a quantificação absoluta pode ser ou cópias de 16S/g de amostra ou cópias de 16S/ng de DNA. No entanto, usar cópias de 16S/g de amostra é geralmente mais preciso e preferível. Esta abordagem considera as variações na quantidade de material inicial, levando a resultados mais fiáveis e interpretáveis na análise de comunidades microbianas.

4. O que são OTUs e ASVs?

Unidades Taxonómicas Operacionais (OTUs) servem como agrupamentos consolidados de sequências semelhantes, delineadas com base em um limiar de similaridade predefinido, frequentemente fixado nos 97%. Por outro lado, Variantes de Sequência de Amplicon (ASVs) representam sequências de máxima precisão ao nível de um único nucleótido; são derivadas através de algoritmos de desruído, incorporando assim variantes de sequência distintas.

5. Quais são as vantagens de integrar a análise de quantificação absoluta com a metabolómica?

A análise de quantificação absoluta fornece a abundância absoluta de espécies, enquanto as técnicas atuais de metabolómica, como a metabolómica direcionada e não direcionada, produzem as concentrações absolutas de metabolitos. A integração de dados do microbioma e do metaboloma normalmente envolve a correlação das abundâncias relativas das espécies com as concentrações absolutas dos metabolitos, o que pode levar a conclusões erradas. Portanto, é fortemente recomendado que as análises de correlação subsequentes se baseiem nas abundâncias absolutas das espécies e nas concentrações absolutas dos metabolitos. Esta abordagem produz resultados mais precisos e fiáveis.

A comunidade sintética derivada do rizosfera de melancia enxertada proporciona proteção para melancias não enxertadas contra Fusarium oxysporum através de efeitos sinérgicos microbianos

Jornal: Microbioma
Fator de impacto: 16,837
Publicado: 05 de Junho de 2024

Fundo

A investigação destacou o papel significativo das comunidades microbianas da rizosfera na saúde e crescimento das plantas. Estratégias como o cultivo de culturas resistentes e o Transplante de Microbiota da Rizosfera (RMT) são reconhecidas como ferramentas eficazes para o manejo de doenças das plantas. Estudos recentes enfatizaram o conceito de "microbioma central" nas rizosferas das plantas, que compreende espécies microbianas intimamente ligadas à planta hospedeira em diversos ambientes. O surgimento de Comunidades Sintéticas (SynComs) oferece uma abordagem nova para melhorar a saúde das plantas em ambientes não estéreis. Este estudo teve como objetivo investigar o impacto das comunidades microbianas da rizosfera de melancia enxertada na resistência a doenças e avaliar a eficácia dos SynComs na promoção da saúde das plantas. Além disso, desenvolveu uma metodologia eficiente para a construção e simplificação de SynComs funcionais com base em interações sinérgicas entre os membros da comunidade.

Métodos

Resultados

Os efeitos protetores do SynCom foram investigados através da comparação das composições das comunidades microbianas da rizosfera e dos perfis metagenómicos entre diferentes grupos de tratamento. A inoculação com SynCom normalizou a diversidade microbiana em resposta à infestação por patógenos, com aumentos notáveis nas abundâncias relativas de géneros benéficos como Pseudomonas e Streptomyces. Além disso, a inoculação com SynCom levou a redes microbiomas mais complexas, com maior estabilidade e coesão da comunidade, potencialmente facilitando a resistência a doenças.

Fig 1. Alterações na composição da comunidade microbiana da rizosfera e no perfil funcional em plantas inoculadas com SynCom.

A análise metagenómica revelou propriedades funcionais distintas desencadeadas pelo SynCom na comunidade da rizosfera. Foram observadas diferenças significativas na abundância das vias KEGG entre os grupos tratados com SynCom e os grupos de controlo, com vias enriquecidas relacionadas com o sistema de dois componentes e a formação de biofilme. Em particular, Pseudomonas mostrou um aumento notável na abundância após a inoculação com SynCom, demonstrando uma colonização eficaz e uma correlação negativa com patógenos da rizosfera. Análises adicionais destacaram o enriquecimento de genes associados à via de formação de biofilme de Pseudomonas, originários principalmente de membros do SynCom, sugerindo um papel fundamental de Pseudomonas na supressão de doenças e promoção do crescimento em plantas de melancia.

As interacções sinérgicas entre os membros do SynCom e Pseudomonas contribuem para o crescimento e colonização de Pseudomonas na rizosfera, melhorando o crescimento das plantas. A análise do potencial competitivo e das interacções entre as estirpes principais revelou baixa competição e correlações positivas. Experimentos de co-cultura in vitro demonstraram que certas estirpes do SynCom promoviam o crescimento de outras, com análises metabolómicas a identificarem potenciais metabolitos de alimentação cruzada. No geral, estas descobertas destacam a importância da facilitação metabólica na promoção da cooperação sinérgica entre os membros do SynCom e Pseudomonas.

Fig. 2. Matriz de interação in vitro e perfis de depleção de substrato entre estirpes individuais de SynCom.

Conclusão

Este estudo revela que as bactérias do rizosfera central de plantas de melancia enxertadas formam um SynCom, controlando efetivamente doenças e promovendo o crescimento em plantas não enxertadas. O aumento da abundância de Pseudomonas e a formação aprimorada de biofilmes sugerem o seu papel crucial na saúde das plantas. Ensaios in vitro demonstram a facilitação metabólica entre os membros do SynCom e Pseudomonas, levando a um SynCom simplificado com efeitos de promoção de crescimento mantidos. Isso destaca o potencial dos SynComs na proteção das plantas contra estresses bióticos, enfatizando a importância de compreender e manipular as interações microbianas no rizosfera para a gestão ecológica da saúde das plantas.

Referência

1. Qiao Y, Wang Z, Sun H, et al. A comunidade sintética derivada do rizosfera de melancia enxertada oferece proteção para melancia não enxertada contra Fusarium oxysporum através de efeitos sinérgicos microbianos. Microbioma, 2024, 12(1): 101.