O que é o sequenciamento de DNA genómico?
O sequenciamento de DNA genómico é um método sofisticado que se baseia em estratégias de sequenciamento de alto rendimento superiores para investigar minuciosamente a totalidade do DNA genómico de um organismo. O objetivo central deste modus operandi científico é alcançar uma compreensão profunda da informação genética encapsulada dentro do organismo. Esta técnica tem uma importância excecional na investigação biológica, fornecendo uma base sólida de dados para dissecção da intrincada ligação entre genes, doenças e fenótipos. A implementação do sequenciamento de DNA genómico aprimora a nossa percepção da funcionalidade biológica de um organismo, das correntes subjacentes que impulsionam a patogénese das doenças e do progresso direcional da evolução biológica.
Qual é o Método de Sequenciação de DNA Genómico?
Atualmente, as tecnologias de sequenciação de DNA podem ser sucintamente divididas em três grupos principais. A categoria inicial abrange a convencional Tecnologia de Sequenciação de Sanger, comumente referido como sequenciação de primeira geração, amplamente reconhecido como o padrão ouro no setor de diagnóstico clínico. A categoria subsequente integra a sequenciação de alto rendimento (HTS) ou sequenciação de nova geração (NGS) tecnologias, ambas demonstradas para processar rapidamente um enorme volume de moléculas de DNA, exibindo uma eficiência sem igual. A última categoria inclui tecnologias de sequenciação de moléculas únicas, que, desprovidas da dependência da amplificação por PCR, podem sequenciar diretamente moléculas de DNA individuais. Esta última categoria é frequentemente denominada tecnologia de sequenciação de terceira geração.
Sequenciação de Sanger
O Método de Sequenciação de Sanger, uma técnica arquetípica na sequenciação de ADN, baseia-se na estreita ligação entre primers específicos e moléculas de ADN molde. Ao longo do processo de sequenciação, a ADN polimerase catalisa a adição progressiva dos quatro tipos de trifosfatos de desoxirribonucleotídeos (dNTPs) às moléculas de ADN molde ligadas ao primer. A síntese de novas cadeias de ADN é facilitada pela formação de ligações covalentes entre o átomo de carbono 3' de uma molécula de desoxirribose e o átomo de carbono 5' do nucleótido subsequente. Este processo perpetua até encontrar um terminador, ddNTP, que carece de um átomo de oxigénio na extremidade 3', levando à cessação da síntese da cadeia de ADN.
NGS
Comparado ao método de sequenciação de Sanger, tecnologias de sequenciação de alto rendimento como o sequenciamento Illumina demonstram eficiência, capacidade de produção e rentabilidade superiores. Atualmente, emergiu como um método prevalente na pesquisa genómica moderna, encontrando aplicações generalizadas em vários campos.
Aproveitando tecnologia NGS facilitou com sucesso a execução simultânea de milhões de reações de sequenciação, marcando um notável avanço técnico. No passado, sequências de nucleótidos fiáveis só podiam ser obtidas através da operação coordenada de oito misturas de reação diferentes. Agora, no entanto, a informação da sequência de bases pode ser identificada diretamente durante o processo síncrono de extensão e deteção da sequência.
Com o advento da tecnologia NGS, o âmbito de aplicação da genómica expandiu-se significativamente. Atualmente, o sequenciamento de DNA tornou-se um componente integral em múltiplos domínios, incluindo ciência básica, investigação translacional, diagnóstico médico e ciência forense. Apesar dos notáveis sucessos da tecnologia NGS na redução de custos e tempo, o relativamente curto "comprimento de leitura" que gera contribui para exigências computacionais elevadas para a subsequente montagem do genoma. No entanto, mantemos uma perspectiva otimista de que, com o contínuo avanço tecnológico e otimização, estes desafios serão gradualmente resolvidos.
Visão geral de várias tecnologias de NGS (Heena Satam et al., Biologia 2023)
Sequenciação de Molécula Única
Sequenciação de molécula única, também conhecida como sequenciação de leitura longa, está a atrair uma atenção crescente da comunidade científica devido à sua superioridade no domínio da leitura de longas sequências. Tecnologias deste tipo caem principalmente em duas categorias: Sequenciação em Tempo Real de Molécula Única (SMRT) e sequenciação por nanopore.
Os Nossos Serviços de Sequenciação de DNA
Equipados com plataformas NGS avançadas, tecnologias de ponta e acompanhados por cientistas especializados, a CD Genomics oferece uma ampla gama de soluções genómicas para atender aos seus diversos objetivos de pesquisa e orçamentos.
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O Sequenciamento de Genoma Completo (WGS), uma técnica revolucionária, é agora amplamente utilizado na investigação do genoma humano/animal. A sua tarefa fundamental é examinar e ordenar de forma abrangente a sequência completa do genoma dentro de uma célula biológica, capturando meticulosamente todos os tipos de mutações desde o primeiro até ao último DNA. Isto tem implicações significativas para aprofundar a nossa compreensão da informação genética de um organismo, dos mecanismos de doenças e das relações entre genes e características.
O desenvolvimento e a aplicação do Sequenciamento de Genoma Completo vão além da humanidade, estendendo-se a outros setores biológicos. Em organismos com ausência de genomas de referência adequados ou aqueles com genomas de referência de baixa qualidade, de novo sequenciação e as técnicas de montagem são notavelmente valiosas. Através da WGS, os investigadores podem obter a informação do genoma completo de um organismo, fornecendo importantes fundamentos para investigações adicionais sobre as funções dos genes, a evolução do genoma, as redes de regulação genética, entre outros.
Em aplicações práticas, o Sequenciamento de Genoma Completo alcançou conquistas reconhecidas globalmente. Por exemplo, o SGC conseguiu decifrar com sucesso as sequências genómicas de vários animais e plantas, fornecendo um suporte robusto para a investigação em áreas como a agricultura e a medicina. Além disso, o SGC desempenha um papel crucial na deteção de micróbios patogénicos, genética forense e estudos de biodiversidade, entre outros.
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Dentro do genoma humano, o número de exões aproxima-se de 180.000, constituindo 1-2% da entidade genómica total, cerca de 30MB em termos computacionais. As mutações patogénicas nas regiões codificadoras de proteínas do genoma humano representam cerca de 85% das alterações patológicas totais. O Sequenciamento de Todo o Exoma (WES) é uma técnica instrumental que privilegia a amplificação de sequências de DNA das regiões exónicas através da hibridização de sondas, antes de realizar metodologias de sequenciamento de alto rendimento. O objetivo principal aqui é identificar e investigar mutações genéticas associadas a doenças e métricas evolutivas dentro das regiões codificadoras e regulatórias (Regiões Não Traduzidas, UTR). A colagem disto com dados de exoma disponíveis publicamente ajuda na interpretação mais profunda da relação entre várias mutações e os mecanismos de doenças subsequentes.
Em relação ao WGS, o Sequenciamento do Exoma Total apresenta várias vantagens: a) Custo-efetividade: comparado com o WGS, o Sequenciamento do Exoma Total oferece uma profundidade de cobertura superior e uma precisão de dados melhorada, tornando-se uma escolha economicamente preferível; b) Profundidade de sequenciamento: a profundidade de sequenciamento pode ultrapassar 120x; c) Capacidade de alto rendimento: o WES é adequadamente adequado para estudos em grande escala envolvendo numerosas regiões-alvo; d) Alta precisão: uma cobertura de sequenciamento profunda acompanha uma alta precisão de dados, proporcionando resultados bem otimizados.
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O sequenciamento direcionado é uma técnica que envolve principalmente o sequenciamento de amplicões em multiplex e o sequenciamento por captura híbrida. Isola genes ou regiões genómicas específicas para sequenciamento. Quando comparado com o WGS e o WES, o sequenciamento direcionado apresenta as seguintes vantagens:
Permite o sequenciamento de alta precisão de genes vitais com um sequenciamento profundo que excede 500x, levando assim à identificação precisa de variações raras.
É economicamente eficiente, facilitando o estudo de genes associados a doenças.
Capaz de identificar variações de frequências alélicas tão baixas quanto 5%.
Durante uma única deteção, é possível realizar uma identificação fiável de mutações hereditárias.
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O DNA mitocondrial (mtDNA) é uma molécula dentro do citoplasma das células, onde a sua estrutura, localização e quantidade exercem uma influência direta nas funcionalidades fisiológicas e no destino da célula viva. A tecnologia de sequenciação do DNA mitocondrial é uma biotecnologia revolucionária, que visa especificamente analisar a sequenciação do mtDNA - o orgânulo fundamental responsável pelo metabolismo energético dentro da célula.
Ao revelar um mapa intricado da composição do DNA dentro de uma célula, a tecnologia de sequenciação do DNA mitocondrial permite a quantificação e análise precisas das características estruturais do DNA. Esta tecnologia pinta um retrato detalhado das características fenotípicas celulares, abrindo assim uma nova via de investigação para os cientistas. A tecnologia fornece aos investigadores um meio preciso e rápido para explorar profundamente a estrutura interna do DNA da célula e as suas funcionalidades. Mais importante ainda, desempenha um papel fundamental na revelação dos mistérios associados à estrutura genética das espécies e às suas respostas às variações ambientais.
Assim, a tecnologia de sequenciação de ADN mitocondrial não apenas fornece aos investigadores uma metodologia de pesquisa mais eficaz, mas também serve como um ponto de referência valioso no âmbito da saúde humana e da investigação médica.
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As mitocôndrias, organelas integrais encontradas em células eucarióticas, têm a responsabilidade de codificar genes relacionados à sua função, participando ativamente em numerosos processos vitais. O DNA mitocondrial humano, caracterizado pelas suas propriedades únicas e pela sua estrutura circular compacta de dupla hélice, cativou a comunidade científica.
O DNA mitocondrial humano, com aproximadamente 16 mil pares de bases de comprimento, codifica uma abundância de genes para apoiar o seu papel fundamental dentro da célula. A sua simplicidade estrutural, juntamente com as regiões codificantes altamente conservadas, implica uma estabilidade evolutiva da sua sequência genética, o que ajuda significativamente na pesquisa funcional.
A herança materna do DNA mitocondrial confere-lhe um estatuto único na investigação genética. Como o DNA mitocondrial é predominantemente transmitido da mãe para a descendência, possui um valor crucial no estudo de doenças hereditárias. Além disso, a rápida taxa de evolução do DNA mitocondrial sublinha o seu papel fundamental no processo de evolução biológica.
Simultaneamente, a baixa taxa de recombinação do ADN mitocondrial sugere que possui um alto valor na investigação sobre mutação genética e variação genética. Notavelmente, o elevado número de cópias do ADN mitocondrial atesta a sua função vital dentro da célula.
Para aprofundar as complexidades do DNA mitocondrial, os investigadores utilizam a tecnologia de captura por sonda de hibridização líquida para enriquecer o DNA mitocondrial, facilitando a investigação de sequenciamento em alta capacidade. Esta metodologia poderosa desmistifica aspetos do DNA mitocondrial e estabelece uma base sólida para compreender o papel indispensável das mitocôndrias no teatro das atividades da vida.
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Os cloroplastos estão entre os organelos mais cruciais e prevalentes nas células vegetais, servindo como o local central para a fotossíntese. A informação sobre a estrutura e a sequência dos genomas de cloroplastos tem um valor significativo na revelação das origens, mudanças evolutivas e relações filogenéticas de diferentes espécies. Simultaneamente, a tecnologia de transformação de cloroplastos demonstra um potencial considerável em melhorias genéticas e na produção de compostos bioativos, sendo a análise da estrutura e sequência dos genomas de cloroplastos a pedra angular deste processo de transformação.
Tradicionalmente, a aquisição do genoma do cloroplasto de uma planta envolveu o design de primers degenerados utilizando as sequências conservadas do genoma do cloroplasto, a amplificação de sequências desconhecidas e a amplificação por PCR longa. Este produto amplificado passa por sequenciação Sanger, e as sequências são então montadas para obter o genoma completo do cloroplasto. No entanto, este processo tende a ser demorado.
Com a evolução da tecnologia científica e o surgimento de novas ferramentas de sequenciação, numerosos investigadores demonstraram recentemente entusiasmo pela sequenciação de alto rendimento. Neste método, os cloroplastos são primeiro isolados, seguidos pela extração do cpDNA. Com base em referências selecionadas do genoma cloroplastidial, é então utilizado software para montar estas sequências, resultando, em última análise, num genoma cloroplastidial completo. No entanto, este método pode não ser aplicável a todas as espécies. Por exemplo, as folhas de plantas superiores frequentemente contêm grandes quantidades de pigmentos e taninos, tornando o isolamento de cloroplastos e a extração de cpDNA desafiadores.
Dependendo dos requisitos específicos da espécie-alvo, pode ser realizada a extração total de DNA ou a extração de cpDNA. A informação sobre o estado taxonómico é utilizada para procurar sequências mitocondriais de referência, e primers degenerados são desenhados para realizar a captura de PCR, amplificação de sequências desconhecidas e amplificação de PCR longa. No final, a sequência completa do genoma do cloroplasto é obtida através de uma combinação de sequenciação de alto rendimento e sequenciação de Sanger.
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Os plasmídeos e os fagos são ferramentas-chave na investigação genética moderna, frequentemente utilizados para clonagem, construção de vetores e biologia sintética. O nosso Sequenciação Completa de Plasmídeos/Fagos o serviço permite uma análise completa e em alta resolução destes elementos genéticos, ajudando os investigadores a validar construções e a detetar mutações com confiança.
Ao contrário do sequenciamento parcial ou do mapeamento de restrição, o sequenciamento completo de plasmídeos/fagos fornece uma cobertura total—incluindo o inserto, a espinha dorsal e as regiões regulatórias—tornando-o ideal para aplicações como terapia génica, desenvolvimento de vacinas e engenharia microbiana. A capacidade de confirmar a integridade da sequência é especialmente crítica para submissões regulatórias e estudos funcionais subsequentes.
Embora plasmídeos grandes ou altamente repetitivos possam ser desafiadores, a nossa plataforma combina sequenciação de leitura longa com pipelines avançados de correção de erros para garantir uma montagem e anotação precisas—mesmo em construções complexas.
Por que é importante:
Valida a estrutura completa do plasmídeo/fago, não apenas os inserções.
Deteta mutações, rearranjos e modificações fora do alvo.
Suporta aplicações em biologia sintética, terapia génica e design de vacinas.
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Os receptores de células T (TCRs) e os receptores de células B (BCRs) determinam como o sistema imunológico reconhece e responde a ameaças. O nosso TCR/BCR-Seq os perfis de serviço o repertório completo destes recetores imunitários, revelando padrões de diversidade, expansão clonal e respostas específicas a antígenos.
Ao capturar as regiões variáveis dos transcritos de TCR e BCR, este método permite que os investigadores acompanhem a dinâmica imunológica em doenças, imunoterapia e desenvolvimento de vacinas. Desde linfócitos infiltrantes de tumor até assinaturas autoimunes, os dados fornecem informações críticas sobre o estado e a função imunológica.
O que distingue o nosso serviço é a combinação de sequenciação profunda, reconstrução de dupla cadeia (por exemplo, TCRα/β ou IgH/IgL) e bioinformática personalizada que lida com regiões hipervariáveis com alta sensibilidade.
As aplicações incluem:
Monitorização das expansões clonais de células T e células B no câncer e na infeção
Caracterização dos repertórios imunes em resposta à imunoterapia
Investigação da disfunção imunitária na autoimunidade e transplante
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A sequenciação de amplicons é uma técnica poderosa que utiliza primers universais específicos para amplificar regiões variáveis do 16S rDNA/18S rDNA/ITS ou genes funcionais dos microrganismos em ambientes variados. Subsequentemente, através da sequenciação de alto rendimento, examinamos a variação de sequência e a informação de abundância dos produtos da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Esta abordagem facilita a análise da diversidade e dos padrões de distribuição das comunidades microbianas dentro de determinados ambientes, desvendando assim a abundância relativa e as relações evolutivas entre a vasta gama de espécies de microrganismos presentes em amostras ambientais.
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O Sequenciamento do Genoma Completo de Vírus (VWGS) envolve uma análise abrangente da sequência genómica de vírus através de plataformas de sequenciamento de segunda e terceira geração. Aproveitando metodologias bioinformáticas, esta abordagem interpreta a informação codificadora e realiza investigações aprofundadas sobre os sistemas patogénicos virais e a trajetória evolutiva dos seus genomas. Disciplinas como a genómica estrutural e a genómica comparativa, incluindo análise diferencial, análise de genes homólogos, análise de colinearidade e análise da evolução das espécies, adotam tais técnicas para examinar estes aspetos de perto. Esses esforços melhoram a nossa compreensão da diversidade viral, ecologia, adaptabilidade e padrões evolutivos, ajudando a prever a ocorrência de doenças infecciosas emergentes.
A investigação sobre o genoma do cloroplasto tem uma importância significativa nas ciências da vida. A sua singularidade é demonstrável na revelação de questões fundamentais, como a origem e a evolução das espécies, e a sua aplicabilidade estende-se a outras disciplinas, como a agricultura. Com o rápido desenvolvimento das tecnologias de sequenciação de alto rendimento, o estudo dos cloroplastos tornou-se uma ferramenta poderosa para investigar a origem, a estrutura e as questões evolutivas dos orgânulos celulares. A utilização de plataformas de sequenciação de segunda e terceira geração, a realização de sequenciação de alto rendimento em cloroplastos de plantas e a realização de sequenciação aprofundada e análise bioinformática podem fornecer informações valiosas sobre a sequência do genoma do cloroplasto, os genes codificadores e a evolução genética.
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No campo da investigação genética, a Análise de Longos Amplicões (LAA) tem atraído uma atenção significativa como um método altamente eficiente e prático para a investigação de genes. A LAA, uma técnica baseada na tecnologia PCR, é orientada principalmente para a amplificação de sequências de genes alvo através do design de primers específicos. Ao contrário da amplificação PCR tradicional, a LAA desenha primers para as porções distais das sequências alvo, permitindo a amplificação eficiente de longos fragmentos de ADN. Este método apresenta uma alta eficiência e precisão de amplificação, reduzindo efetivamente a amplificação incorreta devido a ciclos excessivos de PCR.
A LAA pode ser utilizada para obter fragmentos de ADN genómico de alta cobertura, sendo instrumental na desvendar da relação entre a estrutura e a função genómica. Através da amplificação de fragmentos específicos de genes, a LAA pode detectar de forma eficiente os níveis de expressão gênica em diversas amostras, fornecendo uma base para o diagnóstico e tratamento de doenças. Além disso, a LAA pode ser utilizada para a deteção de locais de mutação, oferecendo suporte técnico para o diagnóstico molecular de doenças genéticas e tumores, entre outras condições. Adicionalmente, a LAA pode servir na análise de elementos regulatórios como promotores e potenciadores, explorando assim os mecanismos subjacentes à regulação da expressão gênica.
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O Sequenciamento Genómico de Baixa Profundidade (sWGS) está entre as metodologias de teste genómico robustas e custo-eficazes desenvolvidas com o objetivo de expor variações e informações genéticas associadas dentro do genoma de um indivíduo. Por definição, o sWGS significa sequenciamento de cobertura parcial do DNA genómico, com uma profundidade e alcance de cobertura bastante diluídos em comparação com o Sequenciamento Genómico Completo profundo. Em aplicações práticas, a fragmentação aleatória do DNA genómico seguida do sequenciamento desses segmentos permite um acesso seletivo à informação genómica. A análise desses subconjuntos de informações torna viável a deteção de novas mutações – variações no número de cópias, variações epigenéticas, e mais.
O advento de plataformas de sequenciação de alto rendimento como Illumina, PacBio e Oxford Nanopore facilitou uma rápida evolução do sWGS. Com um elevado rendimento e precisão de sequenciação, estas plataformas são capazes de sequenciar quantidades massivas de amostras em prazos reduzidos. Além disso, o aperfeiçoamento progressivo das ferramentas de análise de dados de sequenciação, incluindo pacotes de software como Bismark e CMap, otimizou substancialmente o processo de gestão e análise de dados de sequenciação, proporcionando assim aos investigadores resultados precisos na deteção de mutações.
Na investigação biomédica, o sWGS é inestimável. Ao comparar os genomas de doentes e de controlos saudáveis, podem-se obter informações significativas sobre mutações genéticas associadas a doenças, proporcionando assim uma base sólida para o diagnóstico de doenças genéticas e terapia génica. Esta técnica permite ainda análises genotípicas e fenotípicas de organismos, revelando a dinâmica entre os genes e o seu ambiente.
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O DNA tumoral circulante (ctDNA) refere-se a fragmentos de DNA que são libertados na circulação sanguínea a partir de células tumorais. Sequenciar estes fragmentos permite-nos determinar informações sobre mutações genotípicas do tumor, fornecendo uma base instrumental para a pesquisa tumoral.
A principal vantagem da sequenciação de ctDNA reside na sua alta sensibilidade e especificidade. Comparado com biópsias de tecido convencionais, a sequenciação de ctDNA pode detectar mutações tumorais numa fase mais precoce, mesmo quando o tamanho do tumor ainda é relativamente pequeno. O espectro de aplicações da sequenciação de ctDNA é amplo, abrangendo identificação do tipo de tumor, subtipagem molecular, seleção de fármacos terapêuticos direcionados, monitorização da eficácia e avaliação do prognóstico, entre outros.
No entanto, o sequenciamento de ctDNA enfrenta vários desafios. Em primeiro lugar, a concentração de ctDNA no corpo é relativamente baixa, o que exige métodos e tecnologias de deteção de alta sensibilidade. Em segundo lugar, a mistura de DNA de células normais e tumorais nas sequências de ctDNA adiciona complexidade à deteção de mutações e à análise de dados. Além disso, a interpretação dos resultados do sequenciamento de ctDNA requer investigação contínua e conhecimentos experiencial acumulados.
Vantagens dos Nossos Serviços de Sequenciação de DNA
Adesão aos mais altos padrões na prestação de soluções genómicas completas.
Especialização em vários aspectos de sequenciação, como design de experiências, construção de bibliotecas de enriquecimento de alvos e análise bioinformática personalizada.
Entrega de serviços de sequenciação rápidos, precisos, fiáveis e acessíveis.
Capacidade de fornecer serviços de sequenciamento genómico para uma ampla gama de amostras, incluindo humano, rato, planta, animal e micróbio.
Missão de facilitar a investigação em genómica ao proporcionar acesso às mais recentes tecnologias na área.
Flexibilidade para personalizar serviços de acordo com as necessidades individuais do projeto e fornecer análises especificamente adaptadas.
Uma abordagem consultiva para identificar as melhores e mais económicas soluções para satisfazer necessidades de investigação específicas.
Apenas para fins de investigação, não se destina a diagnóstico clínico, tratamento ou avaliações de saúde individuais.
Diretrizes para Submissão de Amostras
