Serviços de Sequenciação de ctDNA

Introdução ao Sequenciamento de ctDNA

DNA tumoral circulante (ctDNA) é um tipo de DNA extracelular presente em fluidos corporais, como plasma, soro, líquido cefalorraquidiano, etc. Origina-se principalmente de células tumorais necróticas ou apoptóticas, vesículas extracelulares secretadas por células tumorais e células tumorais circulantes. O tamanho típico do ctDNA está na faixa de 160-180 pares de bases. O ctDNA é um subconjunto de DNA livre de células (cfDNA) e constitui uma proporção relativamente baixa (entre 0,1% e 1%), tornando a sua deteção desafiadora. A maturação de sequenciação de nova geração (NGS) A tecnologia melhorou significativamente a sensibilidade e a precisão da deteção de ctDNA.

O DNA circulante livre (cfDNA) consiste principalmente em DNA de linhagem de células normais, onde o DNA tumoral circulante (ctDNA) em pacientes com câncer é relativamente escasso e altamente variável. Consequentemente, métodos convencionais de análise de DNA, como Sequenciação de Sanger e o sequenciamento por pirofosfato carece da sensibilidade necessária para detectar mutações somáticas no ctDNA plasmático de pacientes com câncer. Atualmente, existem três principais métodos de análise para ctDNA: técnicas de PCR quantitativa representadas pelo ARMS, técnicas de PCR digital representadas pelo ddPCR e técnicas de deteção de alto rendimento baseadas em Sequenciação de Nova Geração (NGS)Nos últimos anos, a espectrometria de massa de ácidos nucleicos e as tecnologias EFIRM também surgiram.

Para aumentar o rendimento e a eficiência da deteção, as tecnologias de sequenciação centradas em NGS são amplamente utilizados para a análise posterior de ctDNA, variando desde genoma completo ou sequenciação do exoma completo para sequenciação direcionada de um genoma limitado. NGS permite o sequenciamento profundo paralelo de alta capacidade de múltiplos segmentos de ácidos nucleicos de genes, facilitando a deteção simultânea de múltiplos genes, várias formas (como mutações, alterações no número de cópias e fusões de genes) e mutações desconhecidas. O envolvimento de múltiplos genes na avaliação do prognóstico e da eficácia do tratamento pode ter um impacto significativo nos resultados prognósticos.

Características da Sequenciação de DNA Tumoral Circulante

Amostragem ConvenienteA análise de ctDNA múltipla, não invasiva, em tempo real e facilmente acessível várias vezes é alcançada através da extração de sangue, eliminando os riscos e o desconforto associados a métodos invasivos, como biópsias e cirurgias para a coleta de tecido tumoral. Nos estágios iniciais de tumores malignos, podem ser detetadas alterações no conteúdo de ctDNA e nos genes.

Tecnologia de Detecção de MaturidadeAlta sensibilidade, alta precisão, baixa taxa de falsos positivos Utilizando NGS A deteção de ctDNA garante alta sensibilidade e precisão, detectando mutações tão baixas quanto 0,1%. Comparado a outros tipos de marcadores tumorais, o ctDNA apresenta uma sensibilidade superior, tornando-o um biomarcador tumoral ideal.

Deteção Abrangente: Ampla Gama de Aplicação Quase todas as células tumorais libertam fragmentos de ADN na corrente sanguínea. Consequentemente, o ctDNA reflete o estado geral dos tumores no corpo. A heterogeneidade impacta significativamente os testes genéticos em tecidos tumorais, mas a deteção de ctDNA mitiga a aleatoriedade e a localidade associadas à heterogeneidade dos tecidos tumorais. Isso garante resultados mais abrangentes e fiáveis para as mutações tumorais.

Vantagens da Sequenciação de ctDNA

• Serviço Abrangente: Oferecemos um serviço tudo incluído, cobrindo todo o processo desde a extração de ctDNA, preparação da biblioteca, sequenciação até à análise de dados.
• Entrada de ctDNA Ultra-Baixa: A nossa tecnologia permite sequenciação com quantidades iniciais de ctDNA tão baixas quanto 10 ng.
• Controlo de Qualidade Rigoroso: Um processo de controlo de qualidade rigoroso é implementado em cada etapa, garantindo alta precisão nos resultados fornecidos aos nossos clientes.
• Análise Bioinformática Especializada: A nossa equipa de bioinformática experiente está preparada para satisfazer as necessidades de análise de dados personalizadas dos nossos clientes.

Aplicação de Sequenciação de ctDNA

• Deteção de Câncer em Estágio Inicial: Ao examinar o DNA tumoral circulante (ctDNA) na corrente sanguínea, torna-se viável identificar mutações específicas do tumor nos estágios iniciais, melhorando assim as perspetivas de diagnóstico precoce.
• Monitorização do Cancro: A monitorização dinâmica dos níveis de ctDNA em pacientes oferece informações sobre as variações na carga tumoral, proporcionando um meio para avaliar a eficácia do tratamento e a progressão da doença.
• Previsão de Recorrência: O ressurgimento ou elevação dos níveis de ctDNA em seguimentos pós-operatórios ou pós-tratamento pode potencialmente prever a recorrência do câncer.
• Terapia Personalizada: Através da análise dos resultados de sequenciação de ctDNA, os clínicos podem elaborar regimes de tratamento personalizados, optando por terapias direcionadas ou modificando as estratégias de tratamento conforme necessário.

O nosso serviço de sequenciação de ctDNA fornecido

Re-sequenciamento do Genoma Completo para ctDNA

Fornecemos sequenciação de genoma completo abrangente para ctDNA, permitindo a análise de vários tipos de mutações transportadas pelo ctDNA, como polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), inserções e deleções (indels) e grandes variações estruturais.

Sequenciação do Exoma para ctDNA

Semelhante ao DNA genómico convencional, uma quantidade suficiente de ctDNA pode ser submetida a sequenciação do exoma para detetar variações nas regiões codificantes.

Sequenciação de Metilação para ctDNA

A sequenciação de metilação para ctDNA é um ponto focal na investigação. Isto inclui a deteção de locais de metilação para genes individuais e a deteção abrangente de locais de metilação em todo o genoma.

Sequenciação de Região Alvo para ctDNA

O nosso painel de região alvo para ctDNA permite a deteção e análise de locais-alvo específicos. Em comparação com sequenciação do genoma completo, este método oferece uma solução mais económica.

Figura 1. Visão geral esquemática dos principais passos para o processamento de amostras de sangue e extração de cfDNA. (Bohers et al., 2021)

Fluxo de Trabalho de Sequenciação de ctDNA

A CD Genomics oferece serviços de sequenciação de ctDNA rápidos e precisos, bem como análise bioinformática.

Especificações do Serviço

	Requisitos de Amostra Tipos de amostras: Plasma, soro ou cfDNA de pacientes com cancro. O plasma é recomendado em vez do soro para minimizar a interferência do cfDNA derivado de linfócitos. Volume da Amostra: Plasma > 5 mL; Soro > 10 mL; cfDNA > 10 ng. Extração de Plasma: 1. Coletar sangue total em tubos com anticoagulante EDTA, evitando congelar; armazenar brevemente a 2-8℃ antes de centrifugação a baixa temperatura para obter plasma. 2. Se a centrifugação a baixa temperatura não for possível, utilize tubos não invasivos STRECK com um estabilizador proprietário para a preservação de sangue total, permitindo a centrifugação à temperatura ambiente. 3. Para eliminar células residuais, o plasma deve ser submetido a uma centrifugação secundária: primeiro a 4℃ a 1600g durante 10 minutos, seguida de uma segunda centrifugação a 4℃ a 16000g durante 10 minutos. Armazenamento de Amostras: Congele rapidamente amostras de plasma e soro em azoto líquido e armazene a -80℃. Evite ciclos repetidos de congelamento e descongelamento durante o armazenamento das amostras. Nota: Os montantes de amostra são apresentados apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.
Clique	Estratégia de Sequenciamento Plataforma Illumina HiSeq 2000
	Análise Bioinformática Controlo de qualidade de dados brutos Limpeza de dados Alinhamento de genoma de referência Chamadas de variantes Anotação de variantes Filtragem de variantes Análise de variantes específicas de tumor Avaliação da carga tumoral ...e mais Nota: Os dados recomendados e os conteúdos de análise apresentados são apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes na Sequenciação de ctDNA para a sua escrita (personalização)

Referências

1. Michail Ignatiadis, et al. A biópsia líquida entra na clínica - questões de implementação e desafios futuros. Nat Rev Clin Oncol. 2021 M
2. Ming Chen, Sequenciação de próxima geração em biópsia líquida: rastreio e deteção precoce do câncer. Genómica Humana. 1 de agosto de 2019; 13(1):34.
3. Carolin M Sauer, Monitorização longitudinal da carga da doença e resposta utilizando ctDNA a partir de pontos de sangue seco em modelos de xenotransplante. EMBO Mol Med. 2022
4. Etienne Giroux Leprieur, Sequenciação de exoma completo de ctDNA sequencial em adenocarcinoma pulmonar avançado com resposta tumoral inicial duradoura a inibidores de pontos de verificação imunológicos e progressão tardia. J Immunoter Câncer. 2020
5. Anjui Wu, Características de metilação de DNA plasmático em todo o genoma do câncer da próstata metastático. J Clin Invest. 2020
6. Jianxia Chen, et al. Design de um ensaio de sequenciação direcionada para detectar mutações raras no DNA tumoral circulante. Teste Genético de Biomarcadores Moleculares. 2019
7. Bohers E, Viailly P J, Jardin F. Sequenciação de cfDNA: abordagens tecnológicas e questões bioinformáticas. Produtos farmacêuticos, 2021, 14(6): 596.

Referências

1. Chen, KZ., Lou, F., Yang, F. et al. Detecção de DNA Tumoral Circulante em Pacientes com Câncer de Pulmão Não Pequenas Células em Estágio Inicial através de Sequenciamento Direcionado. Sci Rep, 2016, 6, 31985.
2. Deveson I W, Gong B, Lai K, et al. Avaliação da validade analítica dos ensaios de sequenciação de DNA tumoral circulante para oncologia de precisão. Biotecnologia da Natureza, 2021, 39(9): 1115-1128.

1. Quais são as vantagens e desvantagens do ctDNA em comparação com os testes histológicos?

• Vantagens: Em comparação com os testes histológicos, a análise de ctDNA oferece métodos não invasivos ou minimamente invasivos, facilita a colheita repetida de amostras, tem tempos de recolha, processamento e reporte mais curtos. Pode superar a heterogeneidade espacial do tumor e fornecer informações em tempo real, relativamente abrangentes, sobre as características moleculares do tumor de um paciente. Além disso, o ctDNA plasmático também pode aumentar a taxa de deteção de mutações em genes condutores.
• Desvantagens: Em contraste com amostras de tecido, o ctDNA do sangue periférico tem um conteúdo mais baixo, o que pode levar a resultados clínicos falsos negativos. A presença de variações germinativas ou mutações de hematopoiese clonal também pode causar falsos positivos se as células brancas do sangue não forem usadas como controlo. Além disso, existem variações nas quantidades de ctDNA libertadas na corrente sanguínea por diferentes pacientes com cancro ou pelo mesmo paciente em diferentes momentos, o que representa desafios para os testes clínicos e a interpretação dos resultados.

2. Por que é que os testes de ctDNA requerem uma sensibilidade mais elevada?

O número de células tumorais no corpo de um paciente com cancro é significativamente inferior ao de células normais, e os níveis de cfDNA no plasma são geralmente baixos. O ctDNA representa apenas 0,1% a 5% do cfDNA, com diferenças substanciais nos níveis de ctDNA no plasma entre diferentes tipos de cancro e estádios da doença. Portanto, em comparação com os testes de tecido, a deteção de ctDNA requer uma maior sensibilidade e especificidade.

As tecnologias atuais utilizadas para biópsia líquida de ctDNA incluem predominantemente ARMS-PCR, PCR digital (ddPCR) e sequenciação de nova geração (NGS).

3. O que é sequenciação não direcionada na análise de ctDNA?

A sequenciação não direcionada na análise de ctDNA refere-se à abordagem de examinar ctDNA sem um foco pré-determinado em alterações específicas, uma metodologia que abrange Sequenciamento do Exoma Completo (WES) e Sequenciação de Genoma Completo (WGS). O WGS, em particular, tem sido utilizado para a análise de ctDNA devido à sua capacidade de revelar variações específicas do tumor sem conhecimento prévio de potenciais mutações. Isso permite a identificação de alterações genéticas associadas à resistência ao tratamento e a localização de novos alvos acionáveis. No entanto, o WGS apresenta desvantagens, como taxas de sensibilidade mais baixas de 5-10%, custos elevados, períodos de deteção prolongados e maior complexidade na análise de dados, tornando a sua integração na prática clínica uma tarefa formidável.

4. Como é realizada a sequenciação direcionada na análise de ctDNA?

Sequenciação direcionada pode enriquecer fragmentos-alvo através de PCR ou captura híbrida. Os desenhos de sequenciação direcionada baseados em PCR utilizam dezenas a centenas de primers de PCR que visam genes específicos para enriquecimento. Os desenhos de sequenciação direcionada baseados em captura híbrida utilizam sondas que visam genes específicos e os enriquecem através de captura híbrida.

5. Quais estratégias são utilizadas para melhorar a sensibilidade e especificidade na análise de ctDNA?

Devido à complexidade de sequenciação de nova geração (NGS) Os fluxos de trabalho, os erros introduzidos durante a construção da biblioteca, o enriquecimento do fragmento-alvo e o sequenciamento levam inevitavelmente a ruído de fundo. Este ruído de fundo pode obscurecer mutações de baixa frequência em amostras de ctDNA, levando a resultados falso-negativos ou falso-positivos, limitando a sensibilidade e a especificidade da deteção de ctDNA. Portanto, a maioria das tecnologias de sequenciamento direcionado baseadas em NGS visa reduzir o ruído de fundo e melhorar a sensibilidade e a especificidade, frequentemente utilizando estratégias de codificação molecular. Inicialmente, foram utilizados códigos de barras de DNA de cadeia simples, mas agora, a maioria das estratégias utiliza códigos de barras de DNA de cadeia dupla. Embora os códigos de barras de cadeia dupla ofereçam melhor supressão de erros, têm uma eficiência relativamente inferior, tornando-os menos ótimos para amostras limitadas de cfDNA em contextos clínicos.

Análise de Sequenciação de DNA Tumoral Circulante de Adenocarcinoma Gastroesofágico

Revista: Pesquisa clínica em câncer
Fator de impacto: 10,86
Publicado: 1 de dezembro de 2019

Fundo

O adenocarcinoma gastroesofágico (AGE) é um problema de saúde global significativo com taxas de sobrevivência limitadas, apesar dos tratamentos ótimos. Embora baseado em tecido sequenciação de próxima geração (NGS) identificou alterações genómicas chave (GAs), a heterogeneidade intrapaciente complica a terapia direcionada. Estudos recentes sugerem que o ctDNA-NGS, oferecendo um método não invasivo, pode orientar melhor a seleção da terapia direcionada ao fornecer uma visão abrangente das GAs e superar algumas limitações do tecido-NGS. Este estudo analisa uma grande coorte de pacientes com GEA utilizando ctDNA-NGS para avaliar os seus limites de deteção, correlação com os resultados clínicos e potencial para prever a resposta à terapia e resistência.

Métodos

Resultados

Os ensaios de cfDNA plasmático dependem da libertação de DNA tumoral (ctDNA) na corrente sanguínea, misturando-se com cfDNA normal. A frequência alélica variante somática tumoral máxima (maxVAF) reflete o maior clone de ctDNA e ajuda a estimar a quantidade total de ctDNA e a subclonalidade. Em pacientes não tratados em estágio IV, um maxVAF mais elevado correlaciona-se com uma maior carga da doença e locais metastáticos específicos, indicando que tanto a localização da doença quanto a extensão afetam significativamente a libertação de ctDNA e a sensibilidade de deteção.

A Fig. 1. A deteçãode ctDNA e o número de alterações detectadas são ditados por locais específicos da doença e pela carga da doença.

A ctDNA-NGS clínica é utilizada para identificar alterações genómicas acionáveis (GAs) e pode potencialmente servir como um biomarcador prognóstico para doenças em estágios iniciais e tardios. Em pacientes com doença localmente avançada, a ctDNA detectável estava associada a uma sobrevivência livre de doença mais curta, e os níveis de ctDNA pós-cirurgia previam a recidiva. Em pacientes com estágio IV avançado, níveis mais elevados de ctDNA (maxVAF) correlacionaram-se com um pior prognóstico. A análise serial de ctDNA-NGS indicou que um declínio significativo no maxVAF durante a terapia de primeira linha previa uma melhor sobrevivência. Entre os pacientes tratados com inibidores de pontos de verificação imunológicos, um maxVAF mais baixo foi associado a uma maior sobrevivência global.

Fig 2. Implicações prognósticas do maxVAF e alterações seriais nos contextos perioperatório e de diagnóstico recente de metástases.

No diagnóstico inicial, a heterogeneidade espacial do HER2 e de outras alterações genómicas (Gas) em pacientes com GEA é significativa. Numa estudo com 34 pacientes com GEA em estágio IV não tratados, o ctDNA-NGS e o tecido-NGS de locais primários e metastáticos mostraram que apenas 26% dos Gas eram universalmente concordantes entre as amostras, destacando o valor complementar de ambos os métodos. O ctDNA-NGS também detectou heterogeneidade temporal e mutações de resistência adquirida após a terapia, o que pode orientar os tratamentos subsequentes ótimos. Isso sublinha a importância de combinar ctDNA-NGS com tecido-NGS para uma avaliação abrangente da heterogeneidade tumoral e dos mecanismos de resistência.

Fig 3. Heterogeneidade espacial e temporal intrapaciente por NGS de tecido em múltiplos locais e NGS de ctDNA.

ctDNA-NGS pode identificar alterações genómicas prognósticas e preditivas (GAs) em pacientes com GEA. As mutações em PIK3CA e BRAF estão associadas a uma sobrevivência pobre, enquanto as amplificações de HER2 e EGFR, quando identificadas tanto por ctDNA-NGS como por tissue-NGS, preveem melhores resultados com terapias direcionadas. A combinação de ctDNA-NGS com tissue-NGS melhora a deteção de GAs, proporcionando uma avaliação mais abrangente para orientar estratégias de tratamento.

Fig 4. Análise de sobrevivência de pacientes com GEA em estágio IV não tratados por GA específico.

Conclusão

Este estudo, o maior do seu tipo, utilizou ctDNA-NGS para analisar 1.630 pacientes com GEA. Estabeleceu limites de deteção, confirmou o valor prognóstico do ctDNA residual pós-cirurgia e mapeou a paisagem das GAs, mostrando que o ctDNA-NGS identifica com precisão GAs acionáveis e mecanismos de resistência. A combinação de ctDNA-NGS com tissue-NGS melhora a deteção, sugerindo que o ctDNA-NGS pode melhorar o monitoramento e o tratamento do GEA, embora sejam necessárias mais validações.

Referência

1. Maron S B, Chase L M, Lomnicki S, et al. Análise de sequenciação de DNA tumoral circulante em adenocarcinoma gastroesofágico. Pesquisa clínica em câncer, 2019, 25(23): 7098-7112.