Análise de Instabilidade de Microsatélites

O que é Instabilidade de Microsatélites

A instabilidade de microssatélites (MSI) é um fenómeno caracterizado por alterações no comprimento dos microssatélites, que são sequências de ADN repetitivas dispersas por todo o genoma. Estes microssatélites, também conhecidos como repetições de sequência simples (SSRs) ou repetições em tandem curtas (STRs), consistem tipicamente em unidades de repetição que abrangem 1-6 nucleotídeos. Nos humanos, os microssatélites residem predominantemente em regiões não codificantes, embora também possam estar presentes em regiões codificantes.

Durante a replicação do DNA, os microssatélites são particularmente suscetíveis a eventos de deslizamento, nos quais a DNA polimerase pode inserir ou deletar unidades de repetição de nucleotídeos, levando a alterações no seu comprimento. Normalmente, essas alterações são corrigidas pelo sistema de reparo de incompatibilidades (MMR). No entanto, quando os componentes do sistema MMR estão defeituosos—devido a mutações ou modificações epigenéticas—surge a instabilidade dos microssatélites.

O que é um Teste de Instabilidade de Microsatélites?

Um teste de MSI é um procedimento diagnóstico concebido para identificar a presença de MSI numa amostra de DNA. Este teste é fundamental para elucidar as bases genéticas de certos tipos de câncer e para adaptar estratégias terapêuticas apropriadas. Os testes de MSI normalmente detetam discrepâncias no comprimento das repetições de microssatélites, que podem indicar defeitos no sistema de reparação de erros de emparelhamento (MMR).

Várias metodologias são empregues para testes de MSI, cada uma com aplicações e sensibilidades distintas. Estes testes são particularmente cruciais no diagnóstico do câncer, nomeadamente para os cânceres colorretais e a síndrome de Lynch, onde níveis elevados de MSI podem indicar uma predisposição genética para o câncer.

Métodos do Teste de Instabilidade de Microsatélites

• PCR com Eletroforese Capilar

O padrão ouro convencional para testes de MSI combina a reação em cadeia da polimerase (PCR) com a eletroforese capilar. Esta abordagem começa com a amplificação de regiões de microssatélites utilizando primers marcados com fluorescência. Subsequentemente, os produtos amplificados são separados por tamanho através da eletroforese capilar, o que permite a deteção e análise de variações nos comprimentos de repetição.

O processo começa com a extração de DNA de amostras de tecido tumoral e normal. Locais de microssatélites específicos são então amplificados através de PCR, com um primer marcado com um corante fluorescente. Os produtos de PCR são submetidos a eletroforese capilar, que os separa com base no tamanho e permite a deteção de MSI ao analisar as diferenças nos comprimentos de repetição. Este método é altamente considerado pela sua especificidade e fiabilidade na deteção de MSI, mantendo o seu status como o padrão-ouro.

• PCR com Análise de Curva de Derretimento de Alta Resolução

Outro método para teste de MSI envolve PCR acoplada à análise de curvas de fusão de alta resolução (HRM). Esta técnica utiliza corantes intercalantes de DNA para monitorizar alterações na temperatura de fusão (Tm) de fragmentos de DNA, o que fornece informações sobre a estabilidade dos microssatélites.

O procedimento envolve a amplificação de fragmentos de DNA na presença de um corante de alta resolução. Após a amplificação, o DNA é gradualmente aquecido enquanto se monitora o sinal de fluorescência para detectar diferenças nas temperaturas de fusão. A análise HRM é particularmente sensível a variações de comprimento menores e é eficaz na identificação de MSI, incluindo alterações de uma única base e pequenas inserções ou deleções.

• Sequenciação de Nova Geração (NGS)

Sequenciação de Nova Geração (NGS) as tecnologias fornecem um método de alto rendimento para detetar MSI através do sequenciamento de múltiplos loci de microssatélites em todo o genoma. Esta abordagem pode ser aplicada através de sequenciação do genoma completo (WGS), sequenciamento do exoma completo (WES)ou sequenciação de regiões alvo (TRS) para identificar MSI e outras variações genéticas.

O processo envolve o uso de tecnologias de sequenciação de alto rendimento para sequenciar regiões de microssatélites. Os dados de sequenciação são então analisados para detetar variações nos comprimentos dos repetições de microssatélites e identificar MSI. A NGS oferece uma visão abrangente da instabilidade de microssatélites juntamente com outras mutações genéticas, proporcionando um perfil genético detalhado do tumor.

Introdução do Serviço de Análise de Instabilidade de Microsatélites

A CD Genomics utiliza o kit da Promega, que é um método baseado em PCR multiplex fluorescente e eletroforese capilar para detetar o estado de MSI. Tipicamente, o sistema de análise de MSI inclui perfis alélicos de comparação de marcadores de microssatélites, envolvendo cinco marcadores de repetição de mononucleotídeos quase monomórficos (BAT-25, BAT-26, MONO-27, NR-21 e NR-24) e dois marcadores de repetição de pentanucleotídeos altamente polimórficos (Penta C e Penta D), que servem como controlo de qualidade para a autenticação de amostras de tecido normal e tumoral correspondentes. Para a deteção de MSI, os tecidos tumoral e normal de cada paciente precisam ser analisados em paralelo. Geralmente, a deteção de MSI em ≥ 30-40% dos marcadores é considerada MSI-alta (MSI-H), enquanto que em < 30-40% dos marcadores é considerada MSI-baixa (MSI-L), ou MSS se nenhum marcador for instável.

Vantagens e Aplicações da Análise de Instabilidade de Microsatélites

• Maior precisão do que IHC, custo-efetivo e tempo de resposta mais rápido do que NGS.
• Triagem para a síndrome de Lynch
• Deteção do prognóstico em câncer colorretal esporádico
• Testes de diagnóstico em uma ampla gama de tumores sólidos

Fluxo de Trabalho para Análise de Instabilidade de Microsatélites

Especificações do Serviço

	Requisitos de Amostra 1) Para tecido normal 5 mL de sangue periférico em tubo de EDTA 5-6 lâminas de tecido FFPE ou bloco contendo apenas tecido não tumoral Podemos tentar isolar tecido não tumoral da amostra tumoral submetida nos casos em que não há tecido alternativo disponível. 2) Para tecido tumoral Tecido FFPE (o bloco de parafina é preferido). NotaÉ necessária uma amostra adicional de tecido normal, não tumoral, do mesmo indivíduo fonte para testes de comparação na Análise de MSI. Nota: Os montantes de amostra são indicados apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.
Clique	Estratégia de Teste Utilizando o Analisador Genético Applied Biosystems® 3500 xL.
	Análise Bioinformática Fornecemos múltiplas análises de bioinformática personalizadas: Análise de curva de fusão de alta resolução Aquisição de dados Análise dos comprimentos de repetição Identificação de MSI Controlo de qualidade Nota: Os dados de saída e os conteúdos da análise recomendados exibidos são apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Dados brutos
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes na Análise de Instabilidade de Microssatélites para a sua escrita (personalização)

A CD Genomics oferece um serviço avançado de análise de instabilidade de microssatélites, aproveitando tecnologias de ponta como PCR, HRM e NGS. Este serviço é projetado para atender às necessidades de investigadores que buscam insights detalhados sobre a instabilidade de microssatélites em vários tipos de câncer. Ao empregar metodologias inovadoras e tecnologias de alto rendimento, a CD Genomics garante uma deteção precisa e fiável de MSI.

Referências:

1. Le, D.T. et al.(2017) A deficiência na reparação de erros prevê a resposta de tumores sólidos ao bloqueio de PD-1. Science 10.1126/scienc.aan6733.
2. Le, D.T. et al.. (2015) Bloqueio de PD-1 em Tumores com Deficiência de Reparação de Erros. New Engl. J. Med. 372, 2509–20.
3. Diretrizes de Prática Clínica da NCCN em Oncologia: Avaliação Genética/Familiar de Alto Risco: Colorretal. Versão 2.2015.
4. Manual Técnico da Promega. Sistema de Análise MSI v1.2. Out 2012.

Os resultados parciais estão apresentados abaixo:

1. Qual é a importância do MSI no diagnóstico do câncer?

A instabilidade de microssatélites (MSI) serve como um marcador crucial indicativo de sistemas de reparação de erros defeituosos e está intimamente associada a vários tipos de câncer, particularmente aqueles ligados à síndrome de Lynch. A deteção de MSI fornece informações essenciais em múltiplas dimensões, incluindo diagnóstico, prognóstico e planeamento do tratamento. Ao identificar a MSI, os clínicos podem caracterizar melhor as bases genéticas do câncer, levando a decisões médicas mais precisas e informadas.

2. Como é que o NGS melhora o teste de MSI?

NGS avança significativamente o teste de MSI ao permitir uma análise abrangente e de alto rendimento de múltiplos loci de microssatélites. Esta tecnologia oferece informações detalhadas sobre tanto o MSI como outras variações genéticas, melhorando assim a precisão e a profundidade da análise genética. A capacidade do NGS de avaliar simultaneamente numerosos loci permite uma compreensão mais holística do genoma, levando a uma maior precisão diagnóstica e potencialmente revelando novos alvos terapêuticos.

3. Pode o teste MSI ser realizado em amostras não tumorais?

Os testes de MSI não se limitam a amostras de tecido tumoral; também podem ser realizados em vários outros tipos de amostras, incluindo amostras de sangue através da análise de DNA tumoral circulante (ctDNA). Embora as amostras de tecido tumoral sejam geralmente preferidas pela sua precisão, a capacidade de utilizar amostras não invasivas expande a praticidade dos testes de MSI em contextos clínicos, particularmente para monitorizar a progressão da doença e a resposta ao tratamento.

4. Quais são os benefícios de usar o serviço de análise de MSI da CD Genomics?

A CD Genomics oferece um serviço de teste de MSI avançado e de alta sensibilidade que aproveita as mais recentes tecnologias genómicas. A empresa fornece soluções personalizadas projetadas para atender às necessidades específicas tanto da investigação como da aplicação clínica. O suporte especializado garante a entrega de resultados de alta qualidade e dados abrangentes, tornando a CD Genomics um parceiro fiável para análises sofisticadas de MSI. O seu compromisso com metodologias de ponta assegura que os clientes recebam as informações mais precisas e acionáveis para os seus projetos.

A amplificação isotérmica a baixa temperatura de microssatélites reduz drasticamente a formação de artefatos de stutter e melhora a deteção de instabilidade de microssatélites no câncer.

Revista: Pesquisa em ácidos nucleicos

Fator de impacto: 16,6

Publicado: 17 de setembro de 2019

Fundo

Microssatélites são sequências de DNA repetitivas utilizadas em investigação genética e diagnósticos de cancro. MSI, uma alteração no cancro devido a defeitos na reparação do DNA, é tipicamente detetada através de PCR e eletroforese capilar. Os autores introduziram a amplificação isoterma a baixa temperatura com amplificação por polimerase recombinante (RPA) como uma alternativa promissora, reduzindo artefatos de PCR e melhorando a deteção de MSI e a chamada de alelos.

Materiais e Métodos

Resultados

Na avaliação de ensaios de LT-RPA com repetições de micro-satélites de mono- a tetra-nucleotídeos em amostras de sangue, o LT-RPA demonstrou uma melhoria significativa em relação ao PCR ao simplificar os perfis de micro-satélites através da redução ou eliminação de picos de stutter, tornando assim a identificação de alelos mais clara e precisa. Isso foi particularmente evidente para micro-satélites desafiadores como BAT26, D18S61 e D12ATA63, onde o PCR frequentemente resultava em picos de stutter e viés de amplificação que complicavam a chamada de genótipos. O sequenciamento de amplicons confirmou ainda que os perfis de LT-RPA eram consistentes com os resultados do PCR, exceto para um polimorfismo específico, e permitiu a identificação precisa de alelos.

Ao avaliar microssatélites de repetições de tri-nucleótidos implicados em doenças genéticas, a LT-RPA amplificou efetivamente repetições de CTG e GAA com picos de stutter reduzidos em comparação com a PCR, embora tenha tido dificuldades com microssatélites FMR1 ricos em CG. Para as repetições CAG do HTT, a LT-RPA forneceu resultados melhorados com condições de reação otimizadas, demonstrando a sua capacidade em lidar com estruturas de repetições complexas.

Figura 1. Perfis de microsatélites de BAT26, D18S61 e D12ATA63 obtidos com quatro amostras de sangue (designadas B1, B2, B3 e B4) de indivíduos saudáveis utilizando PCR (20 ng de DNA em 20 μl) e LT-RPA.

Ao testar o HT17 LT-RPA em diluições seriadas de linhas celulares cancerígenas, o LT-RPA melhorou o limite de deteção (LOD) para instabilidade de microsatélites (MSI), especialmente para deleções menores, ao minimizar picos de stutter que dificultavam a deteção na PCR. O LT-RPA também facilitou uma melhor identificação de alelos mutantes em amostras mistas, abordando os problemas dos picos de stutter presentes na PCR.

Figura 2. O HT17 LT-RPA melhora o limite de deteção de MSI em comparação com a PCR.

Finalmente, o LT-RPA provou ser altamente eficaz na deteção de MSI em amostras de CRC, incluindo aquelas em que a PCR falhou devido a picos de stutter. O método proporcionou melhor clareza e precisão, e a validação com PCR de pequeno volume confirmou os resultados do LT-RPA e detetou alelos mutados adicionais, embora algumas descobertas possam ser artefatos da PCR.

Figura 3. Detecção de MSI em 12 amostras de CRC MMR-deficientes congeladas frescas (S1-S12) utilizando microssatélites HT17 e LT-RPA e PCR.

Conclusão

Os autores desenvolveram um método de RPA a baixa temperatura para microssatélites que reduz artefatos de stutter e simplifica a chamada de alelos. Este método melhora a deteção de MSI em câncer colorretal e demonstra um forte potencial como alternativa à PCR para uso clínico e de investigação.

Referência:

1. Daunay A, Duval A, Baudrin LG, et al. A amplificação isotérmica a baixa temperatura de microssatélites reduz drasticamente a formação de artefatos de stutter e melhora a deteção da instabilidade de microssatélites no câncer. Pesquisa em ácidos nucleicos. 2019, 47(21):e141-.