Sequenciação de Amplicões de 16S/18S/ITS de Comprimento Total

Em termos da vasta experiência em sequenciação, a CD Genomics tem o orgulho de oferecer aos nossos clientes serviços de rRNA 16S/18S/ITS de comprimento completo com a melhor qualidade e o preço mais competitivo.

O que é o sequenciamento de amplicões de comprimento total de 16S/18S/ITS?

O gene 16S rRNA é altamente conservado entre diferentes espécies de bactérias e arqueias, contendo nove regiões hipervariáveis (V1-V9) com comprimentos que variam entre cerca de 30 a 100 pares de bases, as quais variam dramaticamente entre bactérias. As regiões altamente conservadas permitem que os investigadores projetem pares de primers que amplifiquem de forma precisa e fiável a região hipervariável 16S da sua escolha, para alcançar a identificação ou caracterização de diversas comunidades bacterianas.

Semelhante aos genes de rRNA 16S bacterianos, o gene de rRNA 18S eucariota possui regiões conservadas e variáveis. As sequências do gene de rRNA 18S e os seus espaçadores transcritos associados (espaçador interno transcrito; ITS) são utilizados para classificar fungos e eucariotas.

Com base no desenvolvimento da tecnologia de sequenciação, Sequenciação do gene rRNA 16S/18S/ITS é a melhor ferramenta para estudar a taxonomia de bactérias e fungos e a filogenia molecular. Ao tirar proveito de Sequenciação de leituras longas SMRT da PacBio A CD Genomics pode fornecer serviços de sequenciação de rRNA 16S/18S/ITS de comprimento completo para ajudar melhor a sua investigação.

O sequenciamento completo de 16S/18S/ITS implica a extração de ADN microbiano de uma amostra dada, seguida pela amplificação do 16S rDNA, 18S rDNA ou da região ITS na sua totalidade, utilizando primers universais, e o sequenciamento subsequente. Esta metodologia não só aumenta a precisão da identificação de espécies, graças à melhoria da resolução, mas também melhora a precisão na decifração da constituição microbiana dentro das amostras. Consequentemente, isso oferece uma visão mais integrativa sobre a estrutura da comunidade microbiana.

Com uma resolução tão elevada, o foco naturalmente muda para estudos a nível de espécies. Isto representa um progresso significativo em relação a estudos de segunda geração anteriores centrados no nível de género e espécie utilizando 16S. O 16S de comprimento completo de terceira geração pode fornecer uma análise de nível de estirpe mais abrangente e intricada, tornando os resultados gerais da pesquisa mais relevantes para a funcionalidade ecológica. Esta abordagem tem um grande impacto nas correlações multi-ómicas e nas diretrizes e validações experimentais subsequentes, conferindo-lhe um significado significativo. Do ponto de vista da correlação multi-ómica, dados a um nível mais fino frequentemente revelam padrões locais mais claros, abrangendo muitos detalhes que anteriormente foram ou negligenciados ou inacessíveis.

Vantagens do Sequenciamento de Amplicões de 16S/18S/ITS de Comprimento Total

• Leituras mais longas para uma maior precisão.
• Resolução e precisão superiores na identificação de espécies.
• Reconstrução mais precisa de comunidades microbianas.
• Plataforma de sequenciação madura: PacBio SMRT sistema.
• Garantia de dados de alta qualidade.
• Identificação precisa com múltiplas opções para leituras de CCS.
• Experiência rica em projetos.
• Conteúdo de análise diversificado.
• Ciclos curtos com vantagens de preços competitivos.

Aplicações da Sequenciação de Amplicões de 16S/18S/ITS de Comprimento Completo

• Campo médico: Pesquisa sobre a relação entre doenças comuns e a microbiota humana.
• Campo animal: Estudos sobre a relação entre o intestino, o rúmen (como comunidades microbianas produtoras de metano) e a saúde animal/digestão de nutrientes.
• Agrícola campo: Investigação sobre a microbiota da rizosfera e interações com plantas, bem como práticas de cultivo/fertilização agrícola e comunidades microbianas do solo.
• Ambiental campo: Investigações sobre o tratamento de neblina, gestão de águas residuais, degradação de petróleo, tratamento de drenagem ácida de minas e investigação do ambiente marinho.
• Ambientes extremos especiais: Investigação sobre comunidades microbianas em condições ambientais extremas.

Fluxo de Sequenciação de Amplicões de 16S/18S/ITS de Comprimento Total

Especificação do Serviço

	Requisitos de Amostra: DNA genómico ≥ 500ng, concentração ≥ 10 ng/µL, OD260/280 = 1.8-2.0 Tecido: 1-3g, Quantidade Mínima: 1g Talo: 5 g, Quantidade Mínima: 3 g Líquido Intersticial: 3-5 mL, Quantidade Mínima: 1 mL Amostras Ambientais: 3-5g, Quantidade Mínima: 1 g Membrana de filtro de água: 3, Quantidade mínima: 1 Produtos de PCR ≥400 ng
	Sequenciação: Plataformas PacBio Sequel 2000~20000 leituras de CCS por amostra
	Análise de Dados Agrupamento e filtragem de OTUs Análise de OTUs e anotação de espécies PCA, diagrama de Venn. Uma curva de classificação será gerada com base na abundância de OTUs. Diversidade alfa, Diversidade beta, Meta-análise Análise estatística multivariada … (mais disponível mediante pedido)

Pipeline de Bioinformática

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes na Sequenciação de Amplicões de 16S/18S/ITS em Comprimento Total para a sua escrita (personalização)

Referências:

1. Callahan B J, Wong J, Heiner C, et al. Sequenciação de amplicões de alto rendimento do gene 16S rRNA completo com resolução de nucleótido único. Pesquisa em ácidos nucleicos, 2019, 47(18): e103-e103.
2. Lam T Y C, Mei R, Wu Z, et al. Caracterização de diversidade microbiana em digestores anaeróbios com resolução superior utilizando sequenciação de amplicões do gene 16S rRNA completo. Pesquisa em Água, 2020, 178: 115815.
3. Hui M, Wang A, Cheng J, et al. O sequenciamento de amplicões de rRNA 16S de comprimento total revela a variação da microbiota epibiótica associada a duas espécies de camarões da família Alvinocarididae: possivelmente co-determinada pela heterogeneidade ambiental e pelo reconhecimento específico dos hospedeiros. PeerJ, 2022, 10: e13758.

Utilizando os resultados da sequenciação do amplicão 16S rRNA para exibição. (Hui, et al., 2022)

Quais são as vantagens da sequenciação de amplicons de terceira geração?

A sequenciação de amplicões de terceira geração oferece várias vantagens. Aproveitando o Psequenciação de moléculas únicas SMRT da acBio tecnologia, fornece leituras ultra-longas, permitindo a cobertura de regiões completas do subunidade ribossomal pequena 16S/18S/ITS. Isto resolve o desafio técnico dos produtos de leituras curtas, que estão limitados à análise apenas de regiões variáveis locais. Além disso, alcança uma classificação e identificação microbiana verdadeiramente precisas a custos razoáveis.

2. Por que escolher a diversidade microbiana completa?

A técnica de sequenciação de segunda geração analisa principalmente sequências parciais do gene 16S rRNA. No entanto, diferentes investigadores analisam diferentes regiões dos genes 16S rRNA em diversas bactérias, e a escolha de primers de PCR para amplicões de leituras curtas de diferentes regiões hipervariáveis pode influenciar a precisão inferida da comunidade e a sensibilidade a certos grupos bacterianos. Esta situação torna as comparações a nível global em estudos de microbioma desafiadoras. Além disso, devido à informação de mutação limitada transportada por algumas regiões hipervariáveis, a anotação a nível de espécie não pode ser alcançada. Portanto, a diversidade dos microbiomas de segunda geração é tipicamente estudada a nível de género e superior. Em contraste, a sequenciação de terceira geração pode medir todas as regiões hipervariáveis de uma só vez. Esta capacidade elimina as preferências trazidas por primers variados e oferece um novo método para melhorar a resolução taxonómica das comunidades microbianas.

3. Como identificar espécies bacterianas?

Compare as sequências de 16S rDNA obtidas com as sequências de 16S rDNA de referência no GenBank ou Eztaxon. Com mais de 97% de similaridade de sequência, podem ser consideradas como a mesma espécie bacteriana. Para uma identificação mais precisa, devem ser utilizados a hibridização de DNA, o conteúdo de GC genómico e os índices fisiológicos e bioquímicos.

4. Os requisitos para amostras.

Se submeter microrganismos cultivados, por favor, assegure-se de que foram purificados pelo menos três vezes. E indique claramente as condições de cultura. Se for necessário algum meio especial, por favor, forneça-o.
Se submeter amostras de ADN genómico, é necessário um montante superior a 500 ng.
Para microrganismos Gram-positivos, por favor envie amostras de DNA genómico.

5. Qual é o comprimento total da sequência 16S/18S/ITS?

O gene 16S rRNA de micróbios procarióticos tem aproximadamente 1500 bp de comprimento, abrangendo dez regiões conservadas e nove regiões altamente variáveis (V1-V9). Apresenta um elevado nível de conservatividade e especificidade, com as regiões conservadas a refletirem relações filogenéticas entre géneros, e as regiões variáveis a retratarem variações entre géneros. O gene 18S rRNA de micróbios eucarióticos, com um comprimento de sequência variando entre 1500-2000 bp, também apresenta regiões conservadas e variáveis. Devido à sua taxa de evolução conservativa, é adequado para identificação taxonómica ao nível da espécie e acima. O espaçador transcrito interno (ITS) de micróbios eucarióticos, com aproximadamente 500 bp de comprimento, mantém uma alta conservatividade entre diferentes estirpes dentro de uma espécie, mas sofre considerável variação entre espécies. Isso torna-o extremamente policromático, provando a sua ampla aplicação em estudos filogenéticos interespécies e investigação.

Análise do microbioma intestinal de ratos utilizando sequenciação de amplicões de 16S rRNA de comprimento completo

Revista: Relatórios Científicos
Fator de impacto: 4,6
Publicado: 14 de julho de 2016

Resumo

A chegada da tecnologia de sequenciação de próxima geração fortaleceu a clarificação detalhada da composição das comunidades microbianas, apresentando uma precisão e capacidade de processamento melhoradas em comparação com métodos anteriores. Os autores utilizaram plataformas de sequenciação por nanoporo para sequenciar uma biblioteca de amplicões de 16S rRNA de comprimento completo preparados a partir da microbiota intestinal de ratos. Ao nível das espécies, a sequenciação por nanoporo supera a sequenciação de leituras curtas na identificação de mais espécies, contribuindo assim para uma caracterização precisa da composição da comunidade bacteriana.

Métodos

Resultados

1. Comparação estatística entre dados de sequenciação de leitura curta e dados de sequenciação por nanopore.

O conjunto de dados de sequenciação de leituras curtas foi analisado utilizando a abordagem da Unidade Taxonómica Operacional (OTU). Por outro lado, a composição da comunidade microbiana foi determinada com base nos dados de sequenciação Nanopore obtidos através de um método de sistematização, conhecido como análise taxonomicamente supervisionada, que aloca diretamente sequências em categorias taxonómicas com base na similaridade das sequências. Apesar do nível negligenciável de filogenia específica da amostra observado e da taxa de erro relativamente alta (20,4%) identificada a partir das leituras de sequenciação Nanopore, foi alcançada uma alta reprodutibilidade e correlação entre réplicas biológicas. Consequentemente, a aplicação da sequenciação de amplicões Nanopore permite a deteção repetida de 34 tipos principais de sistemas.

Figura 1. Comparação estatística entre dados de sequenciação de leituras curtas e de nanopore.

2. Comparação da composição microbiana determinada por duas plataformas de sequenciamento

Os autores compararam a composição microbiana determinada utilizando duas plataformas de sequenciação. Ambas as plataformas identificaram 8 filos bacterianos e 13 classes bacterianas (como ilustrado). Houve uma notável semelhança estatística entre a sequenciação de leituras curtas e a sequenciação por nanopore em relação às proporções relativas e classes dos filos principais. Em geral, foram observadas semelhanças significativas na composição bacteriana entre as duas plataformas ao nível da ordem, família e espécie. A partir da análise comparativa da composição microbiana analisada de forma independente através das plataformas de sequenciação por nanopore e de leituras curtas, é evidente que a sequenciação por nanopore pode identificar com precisão a composição microbiana ao nível da espécie.

Figura 2. Comparação das composições do microbiota intestinal de ratos entre duas plataformas de sequenciação em classificações mais profundas (ordem a espécie).

3. Detecção de espécies utilizando sequenciação de amplicões de rDNA 16S de comprimento total

Em relação à resolução taxonómica do nível de filo ao nível de espécie, as proporções relativas do Grupo I (ambas as plataformas de sequenciação) e do Grupo III (apenas sequenciação de leituras curtas) diminuíram, enquanto o Grupo II (apenas sequenciação por nanopore) registou um aumento. Neste sentido, postulamos que as leituras longas geradas pela sequenciação por nanopore atravessam múltiplas regiões hipervariáveis e, devido às suas leituras de rDNA 16S quase completas, podem superar a sequenciação Illumina na discriminação da estrutura da comunidade microbiana. Para determinar o impacto de leituras mais longas na análise da comunidade microbiana a nível de espécie, realizámos uma análise filogenética sobre o conjunto de dados composto com base na prioridade e identificámos 16 espécies filogeneticamente distintas distribuídas por 13 géneros (como ilustrado).

Figura 3. Análise filogenética da microbiota intestinal de ratos.

Conclusão

Os autores exploraram o potencial do sequenciador de terceira geração, MinION, na identificação da composição da comunidade microbiana em amostras fecais de rato. Ao empregar sequenciação por nanoporo para sequenciação de amplicões de 16S rRNA de comprimento total, conseguiram determinar de forma rápida, precisa e eficiente a diversidade microbiana ao nível das espécies. O sucesso deste estudo em clarificar a composição da comunidade microbiana é indicativo do potencial futuro do método. Os autores antecipam que esta abordagem irá expandir a aplicabilidade das análises de comunidades microbianas em origens biológicas, clínicas e ambientais.

Referência:

1. Shin J, Lee S, Go M J, et al. Análise do microbioma intestinal de camundongos utilizando sequenciação de amplicões de 16S rRNA de comprimento total. Relatórios científicos, 2016, 6(1): 29681.