Diretrizes para Submissão de Amostras
Por que a Iso-seq de Poly(A) e TAIL é Importante
As caudas de poli(A) são mais do que simples extensões de RNA. Elas atuam como reguladores chave da duração, estabilidade e tradução do mRNA. Os métodos padrão de RNA-seq muitas vezes descartam ou ignoram esta informação, perdendo sinais regulatórios valiosos.
O TAIL Iso-seq aborda esta lacuna. Captura cDNA de comprimento completo, incluindo caudas poli(A) intactas, e fornece uma visão direta do comprimento da poli(A), heterogeneidade e eventos de APA associados. Os investigadores podem relacionar alterações no 3'UTR a ligação de miRNA, identificar uso de APA específico para isoformase explorar como o comprimento da cauda afeta a expressão génica.
Isto torna o TAIL Iso-seq uma ferramenta valiosa para:
- Investigação da regulação do RNA no desenvolvimento
- Estudando as respostas ao stress em plantas
- Explorando a estabilidade do RNA em modelos de cancro
- Apoio ao desenvolvimento de terapias e vacinas baseadas em RNA
Vantagens do TAIL Iso-seq com a CD Genomics
Precisão de comprimento total
A captura TAIL Iso-seq obtém o transcrito completo, incluindo 5'UTR, região codificante, 3'UTR e cauda poli(A). Isto elimina erros de montagem comuns na RNA-seq de leituras curtas e fornece resolução a nível de isoforma.
Perfilagem abrangente de poli(A)
O nosso serviço quantifica distribuições de comprimento da cauda poli(A) em todo o transcriptoma e deteta resíduos não-A (U, G, C) que afetam a estabilidade do RNA e a eficiência da tradução. Isto permite que os investigadores estudem a dinâmica do RNA com um detalhe incomparável.
Análise de APA e 3'UTR
O TAIL Iso-seq identifica locais de poliadenilação alternativa (APA) e caracteriza alterações no comprimento do 3'UTR. Isso ajuda a ligar a APA a mudanças na ligação de miRNA, localização de RNA e regulação pós-transcricional.
Apoio bioinformático rico
Entregamos relatórios prontos para publicação com distribuições de comprimento de cauda, mapas APA, catálogos de isoformas e análises de enriquecimento de vias. Os outputs visuais simplificam a interpretação e podem ser integrados em projetos de multi-ômica.
Fluxo de Trabalho de Tecnologia
A CD Genomics oferece um fluxo de trabalho completo de TAIL Iso-seq, desde a extração de RNA até a elaboração de relatórios bioinformáticos. Cada etapa é otimizada para precisão e reprodutibilidade, garantindo informações fiáveis sobre a regulação do poli(A) e a diversidade de isoformas.
QC de RNAO RNA de entrada é avaliado quanto à integridade (RIN ≥7) e pureza.
Captura de cDNA de comprimento completoOs protocolos preservam caudas de poli(A) intactas e códigos de barras podem ser adicionados para projetos multiplexados.
Sequenciação de leitura longa por nanoporeLê transcrições completas, incluindo 5'UTR, CDS, 3'UTR e caudas poli(A).
Fluxo de trabalho TAIL Iso-seq: desde a QC de RNA, preparação de bibliotecas e sequenciação de long-read com Nanopore até análise bioinformática abrangente e relatórios prontos para publicação.
Métodos de Sequenciação da Cauda Poly(A)—Quando Usar Qual
| Método | Plataforma | O que mede | Resíduos não-A | Rendimento / Custo (relativo) | Forças típicas | Limitações típicas | Bom para |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| TAIL-seq | Illumina (sequenciação do final 3') | Comprimento da cauda em todo o genoma nos extremos 3'; terminoma 3' | Deteta adições terminais U/G | Alto / $$ | Mapeamento sensível das extremidades 3'; liga o comprimento da cauda à degradação. | Processamento de sinal bruto e análise personalizada necessárias; não são isoformas de comprimento total. | Estudos de deadenilação/uridilação; ensaios de estabilidade |
| PAL-seq | Illumina + padrões de fluorescência | Comprimento da cauda usando fluorescência calibrada; características da extremidade 3' | Indireto | Alto / $$ | Padrões internos para comprimento de cauda calibrado; perfilagem robusta em massa | Adicionada bioquímica; configuração especializada; não é de comprimento total. | Distribuições de comprimento de cauda em massa calibradas; comparação de métodos |
| Poly(A)-seq | Illumina (leitura direta de poli(A) em cDNA) | Perfilamento global das caudas de poli(A); cauda mediana por gene | Não é o foco principal. | Alto / $ | Biblioteca mais simples vs TAIL-seq; coortes escaláveis | Isoformas não resolvidas; desafios de homopolímeros | Triagem em grande escala de alterações no comprimento da cauda |
| FLAM-seq | PacBio (cDNA de leitura longa) | mRNA de comprimento completo incluindo a cauda poli(A) | Relatórios de resíduos não-A | Moderado / $$–$$$ | Links estrutura da isoforma + comprimento da cauda por molécula | Acesso PacBio; tempos de execução mais longos | Biologia da cauda resolvida por isoforma; composição da cauda por isoforma |
| PAIso-seq / PAIso-seq2 | PacBio HiFi | Comprimento da cauda em todo o transcriptoma de baixo input; comprimento total | Pode capturar a composição da cauda. | Moderado / $$–$$$ | Leituras HiFi de alta precisão; baixo input (por exemplo, oócitos) | Específico da plataforma; complexidade do método | Amostras preciosas de baixo input; estimativas de cauda precisas |
| FLEP-seq2 | Nanopore (cDNA de leitura longa) | RNA de comprimento completo com comprimento da cauda através de tecidos/espécies | Deteta padrões de cauda | Moderado / $$ | Amigável à profundidade; atlas inter-teciduais; comparações nucleares vs citoplasmáticas | Compromissos de precisão a nível de base em nanoporos | Atlas de tecidos; plantas e organismos não modelo |
| Nano3P-seq | Nanopore (cDNA de captura da extremidade 3') | abundância de RNA + dinâmica da cauda (poly(A) e não-poly(A)) | Deteção de resíduos não-A | Moderado / $$ | Captura RNAs poliadenilados e não poliadenilados; caudas por molécula | Viés de captura no final 3'; requer cadeia de ferramentas. | Curso de tempo de desenvolvimento; dinâmica da cauda em todo o transcriptoma |
Análise Bioinformática
O nosso pipeline interno integra múltiplas camadas de informação:
- Identificação de isoformas: Descoberta de isoformas completas sem viés de montagem.
- Análise da cauda Poly(A): Distribuição, comprimento mediano e deteção de resíduos não-A (U, G, C).
- Mapeamento APA: Identificação de locais de poliadenilação (PACs), variantes de comprimento de 3'UTR e eventos de mudança de APA.
- Análise de correlação: Ligação do comprimento do poli(A) à abundância do transcrito, estabilidade e eficiência de tradução.
- Interpretação funcional: enriquecimento GO e KEGG para genes afetados por APA, previsões de ganho/perda de locais de ligação de miRNA.
Aplicações do TAIL Iso-seq
- Decodificar a resposta ao stress e a biologia do desenvolvimento em plantas – perfilar como o comprimento da cauda poli(A) e a APA mudam sob calor, seca ou transições de desenvolvimento (por exemplo, trabalho de PAL-seq sob choque térmico em Arabidopsis).
- Compreender os mecanismos da doença e descobrir biomarcadores no câncer – identificar novas isoformas, dinâmicas alteradas da cauda poli(A) ou transcritos de fusão que podem impulsionar a patologia ou servir como alvos diagnósticos/terapêuticos (por exemplo, "Iso-Seq de comprimento total e de célula única para pesquisa em câncer")
- Otimizar terapias e construtos de vacinas baseados em mRNA – garantir a integridade do transcrito, a uniformidade do comprimento da cauda e a composição da cauda (incluindo resíduos não-A) para melhorar a tradução e a estabilidade.
- Descoberta de características de culturas e melhoria do melhoramento – utilizar assinaturas de comprimento de cauda e padrões de APA para relacionar com rendimento, vigor híbrido, tolerância ao stress ou expressão específica de tecidos em culturas como arroz, milho e soja.
Requisitos de Amostra para o Serviço TAIL Iso-seq
| Tipo de Amostra | Quantidade Recomendada | Quantidade Mínima | Concentração / Qualidade | Notas |
|---|---|---|---|---|
| RNA total | ≥ 2 µg | 600 ng | ≥ 30 ng/µL | RIN ≥ 8, OD260/280 ≥ 1.8, livre de ADN |
| Células | ≥ 1 × 10⁶ | ≥ 5 × 10⁵ | Alta viabilidade (>80%) | Pellets de congelamento rápido em nitrogênio líquido |
| Tecido (animal/planta) | ≥ 50 mg | ≥ 10 mg | Integridade do RNA RIN ≥ 8 | Remova contaminantes, congele imediatamente. |
| Tecido vegetal (especial) | 50–100 mg por alíquota | – | Integridade do RNA RIN ≥ 8 | Lavar com água DEPC, congelar em azoto líquido. |
| Cultura bacteriana | ≥ 1 × 10⁷ células | – | Integridade do RNA RIN ≥ 8 | Pellet, lavar com PBS, congelar em azoto líquido. |
Diretrizes Gerais
- Submeta amostras em água livre de RNase ou em 10 mM Tris (pH 8.0).
- Evite ciclos repetidos de congelamento e descongelamento.
- Envie amostras em gelo seco para manter a qualidade do RNA.
- Identifique claramente os tubos com códigos curtos (≤4 caracteres alfanuméricos).
- Forneça dados de QC (traces do Bioanalyzer/Tapestation) juntamente com o formulário de submissão.
Entregáveis
- Dados de sequenciação brutos e processados (FASTQ, BAM).
- Catálogo de transcriptoma a nível de isoforma.
- Distribuições de comprimento da cauda de poli(A) e mapas de locais de APA.
- Tabelas de enriquecimento de vias e visualizações integrativas.
- Figuras prontas para publicação e um relatório técnico detalhado.
Perguntas Frequentes (FAQ)
O que é TAIL Iso-seq e como difere do Iso-seq regular ou do RNA-seq?
O TAIL Iso-seq é um serviço de sequenciação de longas leituras (baseado em Nanopore) que captura transcritos de comprimento completo, incluindo a cauda poli(A) nativa, permitindo a medição direta do comprimento da cauda, locais de APA (poliadenilação alternativa) e diversidade de isoformas. A RNA-seq regular frequentemente perde informações sobre a cauda e requer montagem de leituras, enquanto o Iso-seq padrão pode capturar a estrutura do transcrito, mas nem sempre a composição completa da poli(A) e os resíduos não-A.
O TAIL Iso-seq consegue detetar nucleotídeos não-A dentro ou no final de caudas poli(A)?
Sim. O serviço inclui a deteção de resíduos não-adenosina (como U, G, C) tanto na posição terminal como internamente na cauda poli(A). Estes resíduos não-A fornecem informações sobre a estabilidade do transcrito, degradação ou regulação da deadenilação. Ferramentas como tailfindr, nanopolish e outras suportam esta análise.
Qual é a precisão da medição do comprimento da cauda poli(A) com leituras longas do Nanopore?
O TAIL Iso-seq utiliza pipelines de basecalling e processamento de sinal de última geração para estimar o comprimento da cauda por molécula com alta resolução, frequentemente com precisão de um único nucleótido para caudas mais curtas e boa precisão relativa para caudas mais longas. A precisão também depende da qualidade da amostra, do output de sequenciação (.fast5 retention) e da escolha da ferramenta (tailfindr, nanopolish, etc.).
Preciso de um genoma de referência para usar TAIL Iso-seq?
Não, mas ter um genoma de referência ou anotação de transcritos melhora o mapeamento, a identificação de locais de APA e a resolução de isoformas. Em organismos não-modelo, a montagem de long-read de novo combinada com anotação de transcritos sem referência é possível, embora algumas análises (por exemplo, previsão de ligação de miRNA) possam ser mais desafiadoras sem uma boa anotação.
Quais são os requisitos de amostra de entrada para TAIL Iso-seq?
É necessário RNA total de alta integridade (RIN recomendado ≥ 7), livre de contaminantes, com quantidade suficiente dependendo do organismo / tecido; é possível uma menor quantidade de entrada com métodos otimizados. O RNA deve incluir caudas poli(A) intactas e mínima degradação para melhores resultados.
Como lida com o viés de PCR ou a truncagem das caudas poli(A) no pipeline?
Minimizamos o viés utilizando sequenciação de longas leituras (que evita a montagem de fragmentos), capturando transcritos de comprimento completo, retendo dados de sinal bruto (.fast5) para a estimativa do comprimento da cauda e empregando etapas de controlo de qualidade para filtrar RNA truncado ou degradado. A utilização de ferramentas que funcionam com sinal bruto ajuda a garantir uma estimativa precisa da cauda.
Qual é a diferença entre a análise da cauda poli(A) e a análise de APA (poliadenilação alternativa)?
A análise da cauda poli(A) foca no comprimento, composição e modificações da cauda em si no final do transcrito. A análise de APA aborda onde ocorre a poliadenilação — ou seja, mapeamento dos locais de clivagem poli(A), os diferentes comprimentos da região não traduzida 3' (3'UTR) entre isoformas e como isso afeta a regulação (por exemplo, a ligação de miRNA). Ambos são complementares.
Pode o TAIL Iso-seq ser utilizado para estudos comparativos entre condições ou espécies?
Sim. Porque fornece distribuições de comprimento de cauda por isoforma e utilização de locais de APA por amostra, o TAIL Iso-seq suporta comparações entre tecidos, tratamentos ou espécies. Os pipelines estatísticos podem testar diferenças no comprimento da cauda ou na utilização de APA entre grupos.
Quanto tempo levará para eu receber os resultados (bioinformática + entregáveis)?
Os prazos típicos dependem do número de amostras, complexidade e profundidade de sequenciação. O relatório inclui dados de sequenciação brutos + processados, distribuições de comprimento de cauda, mapeamento de APA, catálogos de isoformas e visualizações. (Os tempos específicos de resposta serão fornecidos com base no âmbito do orçamento do projeto.)
Como é que o custo varia com o número de amostras, profundidade ou complexidade do transcrito alvo?
Os custos geralmente aumentam com o número de amostras, a profundidade de leitura necessária e a complexidade (por exemplo, organismo não modelo ou transcritos de baixa expressão). A CD Genomics oferece preços escaláveis; os clientes podem escolher entre níveis de análise padrão ou premium, dependendo da resolução que necessitam (descoberta de isoformas, composição de cauda, precisão de APA).
Estudo de Caso: "Um atlas de RNA de comprimento total de plantas revela regulação específica de tecido e evolutivamente conservada do comprimento da cauda poli(A) em plantas"
Citação: Jia J., Lu W., Liu B., et al. Um atlas de RNA de comprimento total de plantas revela a regulação específica de tecido e a conservação da comprimento da cauda poli(A) entre monocotiledóneas e dicotiledóneas., Plantas da Natureza 2022.
1. Contexto
Os investigadores careciam de um recurso transcriptómico abrangente e completo em plantas que incluísse informação sobre o comprimento da cauda poli(A) através de tecidos e espécies. Métodos anteriores de leitura curta frequentemente falhavam em preservar caudas de poli(A) ou não ligavam as caudas a isoformas de transcritos completos. Esta lacuna limitou as perceções sobre como o comprimento de poli(A), APA (poliadenilação alternativa) e a estabilidade do mRNA variam entre tecidos ou entre espécies de plantas.
2. Métodos
- Utilizou um método baseado em Nanopore sem enriquecimento de poli(A) (FLEP-seq2) para sequenciar RNAs de comprimento completo que retêm caudas de poli(A).
- Amostraram-se sete tecidos diferentes de Arabidopsis thaliana, além do tecido da parte aérea de milho, soja e arroz. Um total de mais de 120 milhões de moléculas de mRNA poliadeniladas foram sequenciadas.
- Comparou as distribuições dos comprimentos das caudas poli(A) entre o núcleo e o citoplasma, diferentes tecidos e entre genes ortólogos em diferentes espécies. Também avaliou a relação entre a meia-vida do mRNA e o comprimento da cauda.
3. Resultados
- Na maioria dos tecidos, os comprimentos das caudas de poli(A) atingiram o pico em cerca de ~20 nt e ~45 nt; no pólen, os picos foram diferentes (~55–80 nt).
- As RNAs nucleares tinham caudas quase duas vezes mais longas do que as caudas do RNA citoplasmático.
- Os genes com meias-vidas de mRNA curtas geralmente tinham caudas de poli(A) mais longas, enquanto os transcritos estáveis tinham caudas com um pico próximo de ~45 nt.
- A comparação entre espécies mostrou que os genes ortólogos tendem a manter uma regulação semelhante do comprimento da cauda, apesar das diferenças entre as espécies.
Figura: As caudas poli(A) nucleares são mais longas do que as caudas citoplasmáticas.Isto mostra a distribuição dos comprimentos das caudas poli(A) nas frações nucleares e citoplasmáticas em várias espécies/têxteis de plantas.
4. Conclusões
- A regulação da cauda de poli(A) é específica do gene, específica do tecido e demonstra conservação evolutiva entre as plantas.
- As diferenças no comprimento da cauda entre o núcleo e o citoplasma e entre os tecidos apontam para uma regulação dinâmica do corte da cauda (deadenilação) e da APA.
- O conjunto de dados fornece um recurso para estudar a estabilidade do mRNA, a tradução, a APA e características regulatórias não codificantes em plantas.
- Apoia o valor do sequenciamento de leitura longa e completa para ligar o comprimento da cauda à função do RNA.
Referências:
- Jia J, et al. Um atlas de RNA de comprimento total de plantas revela a regulação específica de tecidos e conservada entre monocotiledóneas e dicotiledóneas do comprimento da cauda de Poly(A). Plantas da Natureza. 2022
- Wen H, Chen W, Chen Y, Wei G, Ni T. Análise integrativa de Iso-Seq e RNA-seq revela alterações dinâmicas de promotores alternativos, splicing alternativo e poliadenilação alternativa durante a senescência induzida por Angiotensina II em células endoteliais aórticas primárias de rato.. Front Genet. 2023 Jan 19;14:1064624.
- Kuo RI, Cheng Y, Zhang R, Brown JWS, Smith J, Archibald AL, Burt DW. Iluminando o lado obscuro do transcriptoma humano com sequenciação de transcritos de leitura longa.. BMC Genómica. 30 de outubro de 2020;21(1):751. doi: 10.1186/s12864-020-07123-7. PMID: 33126848; PMCID: PMC7596999.
