Sequenciação do DNA Mitocondrial Humano (mtDNA)

Introdução ao Sequenciamento do DNA Mitocondrial Humano (mtDNA)

As mitocôndrias, chamadas de "usinas de energia da célula", são organelas vitais nas células humanas. Os DNAs mitocondriais humanos (mtDNA) formam moléculas circulares de dupla hélice que contêm cerca de 16.569 pares de bases de DNA e codificam 37 genes (Fig. 1). Existem milhares de moléculas de mtDNA, que são altamente mutáveis porque não estão protegidas por histonas. Os mtDNAs mutados coexistem com os do tipo selvagem em um estado chamado heteroplasmia, que tem sido associado a uma ampla gama de doenças humanas, como o Transtorno do Espectro Autista (TEA), a neuropatia óptica hereditária de Leber (LHON), câncer de mama, doença de Alzheimer, doença de Parkinson e hipertensão. Portanto, o genoma mitocondrial é um objeto significativo de pesquisas em diagnóstico clínico.

A CD Genomics desenvolveu painéis que capturam especificamente todo o genoma do DNA mitocondrial humano. Estes são baseados em PCR multiplex e captura por sondas. sequenciação direcionada abordagens que poderiam cobrir 100% do genoma mitocondrial humano. Com este painel, os clientes já não precisam fornecer mtDNA purificado. A enriquecimento de mtDNA é alcançado através da amplificação por PCR multiplex ou captura por sondas do genoma mitocondrial. O mtDNA enriquecido é então submetido a preparação de biblioteca e sequenciação ultra profunda. A CD Genomics fornece esta tecnologia para ajudar os clientes a pesquisar sobre doenças relacionadas com o genoma mitocondrial.

Figura 1. O genoma mitocondrial humano circular.

Vantagens do Nosso Serviço de Sequenciação de DNA Mitocondrial Humano (mtDNA)

• Acesso mais fácil a amostras iniciais: ADN humano, contendo tanto ADN mitocondrial como ADN nuclear.
• Sequenciação ultra-profunda: >1000x de cobertura, com a plataforma Illumina PE150
• Alta precisão: 100% de cobertura de amplicão ou sonda de todas as regiões do genoma mitocondrial.
• Preço mais baixo: que depende do tamanho da amostra, por favor contacte-nos para um orçamento.
• Prazo de entrega mais rápido: 3-4 semanas

Fluxo de Trabalho de Sequenciação do DNA Mitocondrial Humano (mtDNA)

Especificações do Serviço

	Requisitos de Amostra Amostra de PCR multiplex: ADN genómico ≥ 200 ng, Quantidade mínima: 50 ng, Concentração ≥ 5 ng/µL Probes de Sequenciação de mtDNA Humano: DNA Genómico ≥ 500 ng, Quantidade Mínima: 200 ng, Concentração ≥ 10 ng/µL Nota: As quantidades de amostra são listadas apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.
Clique	Estratégias de Sequenciamento Plataformas Illumina Eficiência de captura: 60%~80%
	Análise Bioinformática O serviço de bioinformática de sequenciação padrão de mtDNA humano inclui QC de dados brutos Alinhamento ao genoma de referência mitocondrial Chamadas de variantes (SNP/indel) Análise de anotação A análise de heteroplasmia e haplogrupo está disponível mediante solicitação. Nota: Os dados recomendados e os conteúdos da análise apresentados são apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes na Sequenciação do DNA Mitocondrial Humano (mtDNA) para a sua escrita (personalização)

Resultados de mapeamento e cobertura do sequenciamento de mtDNA, bem como a exibição de perfis patológicos de mtDNA. (Yao et al., 2019)

Referência:

1. Yao Y, Nishimura M, Murayama K, et al. Um método simples para sequenciar o genoma mitocondrial humano completo diretamente a partir de amostras e a sua aplicação em testes genéticos. Relatórios Científicos, 2019, 9(1): 17411.

1. A sequenciação do genoma completo inclui o ADN mitocondrial?

Sequenciação do genoma completo (WGS) abrange inherentemente o ADN mitocondrial no seu âmbito. Esta técnica de sequenciação abrangente envolve a extração e sequenciação tanto do ADN nuclear como do ADN mitocondrial. Devido à abundância de cópias de ADNmt dentro das células, sequenciação do genoma completo garante uma cobertura abrangente do genoma mitocondrial, permitindo a análise simultânea com o genoma nuclear.

2. Quais são os métodos para sequenciar o ADN mitocondrial humano?

Várias metodologias são empregues para sequenciar o DNA mitocondrial humano (mtDNA). As abordagens comuns incluem Sequenciação de Sanger, sequenciação de próxima geração plataformas (por exemplo, sequenciação Illumina) e tecnologias de sequenciação de leitura longa (por exemplo, Tecnologias Oxford Nanopore e Pacific BiosciencesCada metodologia oferece vantagens, desvantagens e aplicabilidades distintas, permitindo que os investigadores ajustem a sua seleção com base em objetivos de pesquisa específicos e considerações de recursos.

Um método para sequenciação de moléculas únicas de comprimento total multiplexadas do genoma mitocondrial humano.

Revista: Nature Communications

Fator de impacto: 16,7

Publicado: 06 de outubro de 2022

Fundo

As mitocôndrias contêm genomas circulares com funções vestigiais. A heteroplasmia pode impactar significativamente a saúde, exigindo a deteção precisa de variantes para diagnóstico e tratamento. Os métodos de sequenciação tradicionais têm limitações, mas tecnologias de leitura longa como ONT e PacBio oferece uma precisão melhorada. O uso de Cas9 para enriquecimento direcionado com a química Q20+ da ONT aumenta a precisão da leitura e reduz custos, tornando-o adequado para amostras de baixa qualidade e ampliando a sua utilização em investigação mitocondrial e aplicações clínicas.

Métodos

Resultados

Os autores refinaram o protocolo de enriquecimento de Cas9-mtDNA para permitir o sequenciamento de moléculas únicas de mtDNA a partir de amostras de gDNA humano, facilitando a multiplexação sem etapas adicionais de codificação. Este método envolve a digestão com Exonuclease V para o enriquecimento de mtDNA, desfosforilação das extremidades do gDNA e clivagem específica de sequência pela endonuclease Cas9 guiada por RNA dupla. Esta abordagem gera um código de barras no local de corte da Cas9, facilitando a preparação da biblioteca e o sequenciamento. Após a clivagem pela Cas9, as amostras são tratadas com Proteinase K para remover a proteína Cas9 ligada, seguidas pela ligação de adaptadores de sequenciamento ONT aos locais de clivagem fosforilados.

Fig. 1 Abordagem de enriquecimento de Cas9-mtDNA, codificação, agrupamento e desmultiplexação para sequenciação de leitura longa.

A análise de enriquecimento de Cas9-mtDNA deteta com precisão a heteroplasmia em SNVs patogénicos em 14 amostras clínicas. O método, sem tratamento com Exonuclease V, alcança uma cobertura variável do genoma mtDNA (×33 a ×2335), correlacionando-se com os níveis de degradação do DNA da amostra. A inclusão de leituras de comprimento total e leituras que começam em códigos de barras de locais de corte específicos do Cas9 aumenta a cobertura e a confiança na chamada de variantes. Todas as heteroplasmias relatadas são confirmadas, com frequências variando de <0,2% a 100%, e nenhuma grande deleção observada. Além disso, são identificados locais polimórficos não patogénicos e variantes de significado desconhecido, sublinhando a importância de avaliar a frequência de variantes dentro da população geral e de haplogrupos específicos.

Tabela 1. Identificação de SNV patogénicos e determinação de heteroplasmia nas amostras clínicas confirmadas com alterações no mtDNA

A análise de enriquecimento de Cas9-mtDNA identifica com sucesso múltiplas deleções de mtDNA em um caso clínico complexo. Usando três gRNAs que abrangem o genoma mitocondrial, o método detecta duas grandes deleções: m.3264_16070del (7,6% de heteroplasmia) e m.10751_14129del (84,1% de heteroplasmia), juntamente com mtDNA selvagem (8,3% de frequência). A comparação com lrPCR e sequenciamento Illumina confirma o benefício do sequenciamento nativo de mtDNA, superando vieses e fornecendo estimativas mais precisas das populações de mtDNA.

Fig. 2 Múltiplas deleções de mtDNA numa amostra clínica.

Conclusão

Este método utiliza a nuclease Cas9 e sequenciação por nanoporo para direcionar e sequenciar de forma eficiente o genoma mitocondrial humano completo. Alcança uma alta cobertura, detectando com precisão SNVs e múltiplas deleções em amostras clínicas. O pipeline de análise personalizado dos autores permite a chamada precisa de variantes e facilita uma análise abrangente do mtDNA, beneficiando o diagnóstico molecular e estudos populacionais. Além disso, tem aplicações potenciais na investigação de mutações somáticas e modificações de DNA, estendendo-se a espécies animais para genética de conservação e pesquisa filogenética.

Referência:

1. Keraite I, Becker P, Canevazzi D, et al. Um método para sequenciação de moléculas únicas de comprimento total multiplexadas do genoma mitocondrial humano. Comunicações da Natureza, 2022, 13(1): 5902.