RIP-Seq

A CD Genomics oferece serviços avançados de RIP-seq utilizando sequenciação de nova geração (NGS)  tecnologia. O nosso serviço de RIP-seq oferece uma análise precisa e abrangente das interações RNA-proteína, fornecendo informações detalhadas sobre as interações de proteínas ligadoras de RNA em várias amostras biológicas.

A Introdução ao RIP-Seq

Cada atividade do ciclo de vida do transcrito, desde o nascimento (polimerases) até a degradação (nucleases), envolve a ligação de proteínas. Além da produção de proteínas, um subconjunto desses transcritos desempenha papéis cruciais em outros processos essenciais, como a regulação epigenética e a proteção do genoma através do silenciamento de transposões. A maioria dos estudos tem se concentrado na caracterização transcriptómica. Acredita-se, no entanto, que os níveis de mRNAs não correlacionam sempre diretamente com os níveis de proteínas em estado estacionário. O interesse em identificar os RNAs associados a proteínas de ligação a RNA (RBP) em um contexto celular está crescendo, à medida que o papel do processamento de RNA e dos eventos de tradução que ocorrem pós-transcricionalmente começa a ser apreciado.

O RIP-Seq mapeia os locais onde as proteínas estão ligadas ao RNA dentro de complexos RNA-proteína. A imunoprecipitação de RNA (RIP) implica a purificação de interações RNA-proteína em condições nativas, utilizando um anticorpo específico para a proteína para mapear a RBP de interesse. O advento das tecnologias de sequenciação, aliado a várias químicas de RIP, permitiu a deteção simultânea de milhares de transcritos ligados (mRNAs, RNAs não codificantes ou RNAs virais) em um único experimento. A genómica CD fornece sequenciação de RNA RIP para obter insights não apenas sobre processos bem estabelecidos, como transcrição, splicing e tradução, mas também em áreas mais recentes, como interferência de RNA e regulação gênica por RNAs não codificantes.

Vantagens do nosso serviço de RIP-Seq

• Na investigação biológica atual, o RIP-seq destaca-se como o método mais eficaz para determinar interacções proteína-RNA no estado natural de uma célula. Esta técnica identifica de forma eficiente se uma proteína é uma proteína de ligação ao RNA, elucida quais RNAs interagem directamente com a proteína e localiza os seus locais de ligação.
• O RIP-seq permite a investigação abrangente das interacções proteína-RNA a nível do transcriptoma completo, lançando luz sobre os tipos de RNAs envolvidos nessas interacções.
• Com a sua alta resolução, o RIP-seq oferece a capacidade de discernir sequências de RNA que interagem com proteínas, proporcionando, em última análise, informações valiosas sobre o intrincado panorama das interações proteína-RNA.
• Custo-Efetividade: O ciclo experimental é curto, a análise é abrangente e o preço é baixo.
• Alta Cobertura: Todo o transcriptoma está coberto, permitindo a triagem e identificação de locais de ligação a proteínas em todo o transcriptoma.
• Alta Sensibilidade: Milhões de etiquetas de sequência podem ser obtidas de cada amostra, permitindo a descoberta de locais de ligação a proteínas raros no transcriptoma.
• Alta Precisão: Dados com alta relação sinal-ruído podem ser obtidos, distinguindo com precisão eventos verdadeiros de ruído e localizando precisamente os locais de ligação de proteínas.
• Plano de Sequenciação por Imunoprecipitação de RNA Personalizado: Planos de sequenciação por imunoprecipitação de RNA personalizados podem ser elaborados com base em necessidades específicas.

Aplicações do RIP-Seq 

• Investigação das Interacções entre RNA e Proteínas dentro das Células
• Identificação das Interacções entre RBPs e RNAs não codificantes (como LncRNAs, miARNs, etc.)
• Mapeamento das Interacções em todo o Genoma entre RNA e RBPs

Fluxo de trabalho RIP-Seq

A CD Genomics aplica a Illumina NGS equipamento para sequenciar os transcritos ligados, revelando interacções a nível genómico de RBPs. Os investigadores irão submeter o RNA extraído pelos métodos de RIP apropriados com base na imunoprecipitação de proteínas específicas a partir de linhas celulares ou tecidos. O nosso serviço de RIP-Seq, que oferece o fluxo de trabalho desde o controlo de qualidade da amostra até à análise de dados, permite um perfil rápido e uma profunda compreensão do RNA.

Fig2. Fluxo de Trabalho do RIP-Seq

Especificações do Serviço

	Requisitos de Amostra RNA IPed ≥ 100 ng, Quantidade Mínima: 40 ng, Concentração ≥ 5 ng/µL Célula ≥ 5×10sete Tecido ≥ 500 mg, Quantidade Mínima: 200 mg Relação OD A260/A280 ≥ 1,8, relação A260/230 ≥ 1,8, RIN ≥ 6 Todas as amostras de RNA total devem estar livres de DNA. O RNA deve ser armazenado em água livre de nucleases ou RNA Stable. Nota: Os montantes de amostra são listados apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.
Clique	Estratégia de Sequenciamento As opções de serviço flexíveis incluem HiSeq X e NextSeq 500 Profundidade de sequenciação: 6-12G
	Análise Bioinformática Fornecemos múltiplas análises de bioinformática personalizadas: QC de dados brutos Alinhamento e quantificação baseada em TPM/RPKM/FPKM Análise de expressão Análise de splicing alternativo anotação GO e KEGG Nota: Os dados recomendados e os conteúdos de análise apresentados são apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes em RIP-Seq para a sua escrita (personalização)

Se tiver requisitos ou perguntas adicionais, não hesite em contactar-nos.

Referência

1. Zhao J et al.Identificação em todo o genoma de RNAs associados a polícromos por RIP-seq. Célula Molecular, 2010 22 de Dez;40(6):939-53

Os resultados parciais estão mostrados abaixo:

Quais são alguns avanços recentes em RIP-seq?

Os recentes avanços em RIP-seq evoluíram significativamente. Esses desenvolvimentos abrangem melhorias na engenharia de anticorpos com foco na especificidade, técnicas de ligação cruzada refinadas que ajudam na superior isolação de complexos RNA-proteína, e a introdução de recursos bioinformáticos sofisticados para a interpretação de dados. Além disso, a integração do RIP-seq com metodologias como CLIP-seq (sequenciação por ligação cruzada e imunoprecipitação) oferece perspetivas suplementares sobre interações RNA-proteína.

2. Como pode ser assegurado o sucesso dos experimentos de RIP-seq?

Validação de Anticorpos: Utilize anticorpos bem caracterizados e de alta afinidade.

Métodos Otimizados: Adira a procedimentos otimizados para lise celular, imunoprecipitação e extração de RNA.

Controlo Adequado: Integre controlos adequados (como controlos de IgG não específicos, RNA de entrada) para discernir interacções específicas de sinais de fundo.

Replicação: Realizar replicados biológicos para confirmar a reprodutibilidade dos resultados.

Integridade dos Dados: Utilize plataformas de sequenciação de alta qualidade e um processo minucioso. bioinformática análises para manter a precisão e fiabilidade dos dados.

3. O que é Input e qual é o seu papel em experiências?

Após a fragmentação do RNA, antes da imunoprecipitação, uma parte da amostra deve ser reservada como controlo de Input (não sujeita a imunoprecipitação). O Input consiste no RNA fragmentado, que, juntamente com o RNA da amostra imunoprecipitada, passa por descrossligação, purificação do RNA e métodos de deteção subsequentes, como PCR. Através da análise de dados subsequente, o controlo de Input permite a exclusão do ruído de fundo (picos falso-positivos causados por ligação não específica), valida a eficácia da fragmentação do RNA e confirma a eficiência da IP ao longo do experimento. Portanto, o controlo de Input é um passo indispensável em experimentos de IP-seq.

RIP-Seq de EZH2 Identifica TCONS-00036665 como Regulador da Miogénese em Porcos

Revista: Fronteiras em Biologia Celular e do Desenvolvimento

Fator de impacto: 6,081

Publicado: 12 de janeiro de 2021

Fundo

A miogénese do músculo esquelético vertebrado envolve células progenitoras reguladas por Pax3 e Pax7, que induzem Myf5 e MyoD para a diferenciação muscular. As células satélites ajudam na regeneração. EZH2, uma proteína Polycomb, é crucial para o desenvolvimento muscular e a regulação gênica através da metilação de histonas. lncARNs interagem com EZH2 para regular a miogénese. Este estudo utilizou RIP-Seq combinado com sequenciação de lincRNA (lincRNAseq) para identificar 356 novos lincRNAs no músculo esquelético de porco, revelando informações sobre os seus papéis, como o TCONS-00036665, que promove a proliferação de células satélites, mas inibe a diferenciação, influenciando assim o desenvolvimento muscular.

Materiais e Métodos

Resultados

Neste estudo, o RIP-Seq identificou lincRNAs ligados à EZH2 a partir de músculos esqueléticos de porcos com 1 mês de idade. Usando a enriquecimento de anticorpos anti-EZH2 validado por Western blotting, os autores realizaram RIP-Seq e lincRNAseq. Os passos de filtragem com base nos níveis de expressão e valores de CPC identificaram 356 lincRNAs ligados à EZH2, predominantemente localizados em regiões intergénicas, sugerindo os seus papéis reguladores na biologia muscular.

Figura 1. A identificação de novos lincRNAs que se ligam ao EZH2.

Figura 2. A verificação de lincRNAs novos que se ligam ao EZH2.

Três lincRNAs, TCONS-00025364, TCONS-00045380 e TCONS-00036665, foram confirmados como ligando-se ao EZH2 através de experiências de RIP-PCR (Figura 2C). TCONS-00036665, alinhando-se com o transcrito EF397601 do porco, partilha semelhanças com o gene NEAT1 humano e de rato, sugerindo o seu envolvimento no desenvolvimento do músculo esquelético. Caracterizações adicionais revelaram que TCONS-00036665 é um transcrito poliadenilado de 3.450 bp, predominantemente localizado nos núcleos de células satélites musculares de porco (PSCs) em proliferação e diferenciação. A análise de expressão indicou que TCONS-00036665 aumenta durante a diferenciação das PSCs, sugerindo o seu papel na regulação dos processos de proliferação e diferenciação.

Figura 3. A caracterização molecular de TCONS-00036665.

Figura 4. A redução de TCONS-00036665 inibe a proliferação de PSC, mas promove a diferenciação de PSC.

A figura 5. A superexpressão de TCONS-00036665 promove a proliferação de PSC, mas inibe a diferenciação de PSC.

Conclusão

Neste estudo, foi investigada a repressão genética mediada por EZH2 no músculo esquelético de porcos. O TCONS-00036665, uma lincRNA que se liga ao EZH2, foi identificado e descobriu-se que regula a proliferação e diferenciação das células satélites musculares ao aumentar o enriquecimento de H3K27me3 mediado por EZH2 nos promotores dos genes-alvo. Os resultados sugerem um novo papel regulador para as lincRNAs no desenvolvimento muscular de porcos através de mecanismos epigenéticos envolvendo o EZH2.

Referência

1. Wang S, Xu X, Liu Y, et al. RIP-Seq de EZH2 Identifica TCONS-00036665 como Regulador da Miogénese em Porcos. Fronteiras em Biologia Celular e do Desenvolvimento, 2021, 8: 618617.