RIP-Seq

A CD Genomics oferece serviços avançados de RIP-seq utilizando sequenciação de nova geração (NGS)  tecnologia. O nosso serviço de RIP-seq fornece uma análise precisa e abrangente das interações RNA-proteína, oferecendo informações detalhadas sobre as interações de proteínas ligadoras de RNA em várias amostras biológicas.

A Introdução ao RIP-Seq

Cada atividade do ciclo de vida do transcrito, desde o nascimento (polimerases) até à degradação (nucleases), envolve a ligação de proteínas. Além da produção de proteínas, um subconjunto destes transcritos desempenha papéis cruciais em outros processos essenciais, como a regulação epigenética e a proteção do genoma através do silenciamento de transposões. A maioria dos estudos tem-se concentrado na perfuração transcriptómica. Acredita-se, no entanto, que os níveis de mRNAs nem sempre se correlacionam diretamente com os níveis de proteínas em estado estacionário. O interesse em identificar os RNAs associados a proteínas ligadoras de RNA (RBP) em um contexto celular está a crescer, à medida que o papel do processamento de RNA e dos eventos de tradução que ocorrem pós-transcricionalmente começa a ser apreciado.

O RIP-Seq mapeia os locais onde as proteínas estão ligadas ao RNA dentro de complexos RNA-proteína. A imunoprecipitação de RNA (RIP) implica a purificação das interações RNA-proteína em condições nativas, utilizando um anticorpo específico para a proteína para mapear a RBP de interesse. O advento das tecnologias de sequenciamento, aliado a várias químicas de RIP, permitiu a deteção simultânea de milhares de transcritos ligados (mRNAs, RNAs não codificantes ou RNAs virais) em um único experimento. A genómica CD fornece sequenciamento de RNA RIP para obter insights não apenas sobre processos bem estabelecidos, como transcrição, splicing e tradução, mas também em áreas mais recentes, como interferência de RNA e regulação gênica por RNAs não codificantes.

Vantagens do nosso serviço de RIP-Seq

• Na investigação biológica atual, o RIP-seq destaca-se como o método mais eficaz para determinar interações proteína-RNA no estado natural de uma célula. Esta técnica identifica eficientemente se uma proteína é uma proteína de ligação ao RNA, elucida quais RNAs interagem diretamente com a proteína e localiza os seus locais de ligação.
• O RIP-seq permite a investigação abrangente das interacções proteína-RNA a nível do transcriptoma completo, lançando luz sobre os tipos de RNAs envolvidos nessas interacções.
• Com a sua alta resolução, o RIP-seq oferece a capacidade de discernir sequências de RNA que interagem com proteínas, fornecendo, em última análise, informações valiosas sobre o intrincado panorama das interações proteína-RNA.
• Custo-Efetividade: O ciclo experimental é curto, a análise é abrangente e o preço é baixo.
• Alta Cobertura: Todo o transcriptoma está coberto, permitindo a triagem e identificação de locais de ligação a proteínas em todo o transcriptoma.
• Alta Sensibilidade: Milhões de etiquetas de sequência podem ser obtidas de cada amostra, permitindo a descoberta de locais de ligação a proteínas raros no transcriptoma.
• Alta Precisão: Dados com alta relação sinal-ruído podem ser obtidos, distinguindo com precisão eventos verdadeiros do ruído e localizando precisamente os locais de ligação de proteínas.
• Plano de Sequenciação por Imunoprecipitação de RNA Personalizado: Podem ser elaborados planos de sequenciação por imunoprecipitação de RNA adaptados a necessidades específicas.

Aplicações do RIP-Seq 

• Investigação das Interacções entre RNA e Proteínas dentro das Células
• Identificação das Interacções entre RBPs e RNAs não codificantes (como LncRNAs, miARNs, etc.)
• Mapeamento das Interacções em Todo o Genoma entre RNA e RBPs

Fluxo de trabalho RIP-Seq

A CD Genomics aplica a Illumina NGS equipamento para sequenciar os transcritos ligados, revelando interacções em todo o genoma de RBPs. Os investigadores irão submeter o RNA extraído pelos métodos de RIP apropriados, com base na imunoprecipitação de proteínas específicas a partir de linhas celulares ou tecidos. O nosso serviço de RIP-Seq, que oferece o fluxo de trabalho desde o controlo de qualidade da amostra até à análise de dados, permite uma rápida caracterização e uma profunda compreensão do RNA.

Fig2. Fluxo de Trabalho do RIP-Seq

Especificações do Serviço

	Requisitos de Amostra IPed RNA ≥ 100 ng, Quantidade Mínima: 40 ng, Concentração ≥ 5 ng/µL Célula ≥ 5×107 Tecido ≥ 500 mg, Quantidade Mínima: 200 mg Relação OD A260/A280 ≥ 1,8, relação A260/230 ≥ 1,8, RIN ≥ 6 Todas as amostras de RNA total devem estar livres de DNA. O RNA deve ser armazenado em água livre de nucleases ou em RNA Stable. Nota: Os montantes de amostra são indicados apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.
Clique	Estratégia de Sequenciamento As opções de serviço flexíveis incluem HiSeq X e NextSeq 500 Profundidade de sequenciação: 6-12G
	Análise Bioinformática Fornecemos várias análises de bioinformática personalizadas: QC de dados brutos Alinhamento e quantificação baseada em TPM/RPKM/FPKM Análise de expressão Análise de splicing alternativo anotação GO e KEGG Nota: Os dados recomendados e os conteúdos de análise apresentados são apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes em RIP-Seq para a sua escrita (personalização)

Se tiver requisitos adicionais ou perguntas, não hesite em contactar-nos.

Referência

1. Zhao J et al.Identificação em todo o genoma de RNAs associados a polícromos por RIP-seq. Célula Molecular, 22 de Dezembro de 2010;40(6):939-53

Resultados da Demonstração

Os resultados parciais estão mostrados abaixo:

Perguntas Frequentes sobre RIP-Seq

1. Quais são alguns avanços recentes em RIP-seq?

Os recentes avanços em RIP-seq evoluíram significativamente. Esses desenvolvimentos abrangem melhorias na engenharia de anticorpos com foco na especificidade, técnicas de ligação cruzada refinadas que ajudam na superior isolamento de complexos RNA-proteína, e a introdução de recursos bioinformáticos sofisticados para a interpretação de dados. Além disso, a integração de RIP-seq com metodologias como CLIP-seq (sequenciação por ligação cruzada e imunoprecipitação) oferece perspectivas suplementares sobre interações RNA-proteína.

2. Como pode o sucesso dos experimentos de RIP-seq ser garantido?

Validação de Anticorpos: Utilize anticorpos bem caracterizados e de alta afinidade.

Métodos Otimizados: Adira a procedimentos otimizados para lise celular, imunoprecipitação e extração de RNA.

Controlo Adequado: Integre controlos adequados (como controlos de IgG não específicos, RNA de entrada) para discernir interacções específicas de sinais de fundo.

Replicação: Realizar réplicas biológicas para confirmar a reprodutibilidade dos resultados.

Integridade dos Dados: Utilize plataformas de sequenciação de alta qualidade e rigoroso bioinformática análises para manter a precisão e fiabilidade dos dados.

3. O que é Input e qual é o seu papel em experimentos?

Após a fragmentação do RNA, antes da imunoprecipitação, uma parte da amostra deve ser reservada como controlo de Input (não sujeita a imunoprecipitação). O Input consiste no RNA fragmentado, que, juntamente com o RNA da amostra imunoprecipitada, passa por descrossligação, purificação do RNA e métodos de deteção subsequentes, como PCR. Através da análise de dados subsequente, o controlo de Input permite a exclusão do ruído de fundo (picos falso-positivos causados por ligações não específicas), valida a eficácia da fragmentação do RNA e confirma a eficiência da IP ao longo do experimento. Portanto, o controlo de Input é um passo indispensável em experimentos de IP-seq.

Estudos de Caso de RIP-Seq

RIP-Seq de EZH2 Identifica TCONS-00036665 como Regulador da Miogénese em Porcos

Revista: Fronteiras em Biologia Celular e do Desenvolvimento

Fator de impacto: 6,081

Publicado: 12 de janeiro de 2021

Fundo

A miogénese do músculo esquelético vertebrado envolve células progenitoras reguladas por Pax3 e Pax7, que induzem Myf5 e MyoD para a diferenciação muscular. As células satélites ajudam na regeneração. EZH2, uma proteína Polycomb, é crucial para o desenvolvimento muscular e a regulação genética através da metilação de histonas. lncARNs interagir com EZH2 para regular a miogénese. Este estudo utilizou RIP-Seq combinado com sequenciação de lincRNA (lincRNAseq) para identificar 356 novos lincRNAs no músculo esquelético de porco, revelando informações sobre os seus papéis, como TCONS-00036665, que promove a proliferação de células satélites, mas inibe a diferenciação, influenciando assim o desenvolvimento muscular.

Materiais e Métodos

Resultados

Neste estudo, o RIP-Seq identificou lincRNAs ligados ao EZH2 a partir de músculos esqueléticos de porcos com 1 mês de idade. Usando enriquecimento de anticorpos anti-EZH2 validado por Western blotting, os autores realizaram RIP-Seq e lincRNAseq. Os passos de filtragem com base nos níveis de expressão e valores de CPC identificaram 356 lincRNAs ligados ao EZH2, predominantemente localizados em regiões intergénicas, sugerindo os seus papéis regulatórios na biologia muscular.

Figura 1. A identificação de novos lincRNAs que se ligam ao EZH2.

Figura 2. A verificação de lincRNAs novos que se ligam ao EZH2.

Três lincRNAs, TCONS-00025364, TCONS-00045380 e TCONS-00036665, foram confirmados como ligando-se à EZH2 através de experiências de RIP-PCR (Figura 2C). TCONS-00036665, alinhando-se com o transcrito EF397601 do porco, partilha semelhanças com o gene NEAT1 humano e de rato, sugerindo o seu envolvimento no desenvolvimento do músculo esquelético. Caracterizações adicionais revelaram que TCONS-00036665 é um transcrito poliadenilado de 3.450 bp, predominantemente localizado nos núcleos de células satélites musculares (PSCs) de porco em proliferação e diferenciação. A análise de expressão indicou que TCONS-00036665 aumenta durante a diferenciação das PSCs, sugerindo o seu papel na regulação dos processos de proliferação e diferenciação.

Figura 3. A caracterização molecular de TCONS-00036665.

Figura 4. A redução de TCONS-00036665 inibe a proliferação de PSC, mas promove a diferenciação de PSC.

A Figura 5. A superexpressão de TCONS-00036665 promove a proliferação de PSC, mas inibe a diferenciação de PSC.

Conclusão

Neste estudo, foi investigada a repressão genética mediada por EZH2 no músculo esquelético de porcos. TCONS-00036665, uma lincRNA que se liga a EZH2, foi identificada e descobriu-se que regula a proliferação e diferenciação das células satélites musculares, aumentando o enriquecimento de H3K27me3 mediado por EZH2 nos promotores de genes-alvo. Os resultados sugerem um novo papel regulador para as lincRNAs no desenvolvimento muscular de porcos através de mecanismos epigenéticos envolvendo EZH2.

Referência

1. Wang S, Xu X, Liu Y, et al. RIP-Seq de EZH2 Identifica TCONS-00036665 como Regulador da Miogénese em Porcos. Fronteiras em Biologia Celular e do Desenvolvimento, 2021, 8: 618617.