Serviço de Sequenciamento de Transcriptoma Espacial 10x

O que é a Transcriptómica Espacial?

A transcriptómica espacial, uma abordagem inovadora para a análise profunda de dados de RNA-seq numa dimensão espacial, permite uma representação abrangente da distribuição de mRNA em cada fatia de tecido individual. Isto, por sua vez, possibilita a localização precisa e a identificação diferencial de genes de função expressos ativamente dentro de uma região específica do tecido. Dado que as células, que representam as unidades básicas de um organismo, desempenham as suas funções biológicas únicas em colaboração com o seu microambiente espacialmente específico, o domínio da informação sobre a posição espacial torna-se fundamental ao investigar mecanismos em biologia celular, oncologia e biologia do desenvolvimento.

Graças aos avanços nas tecnologias de imagem microscópica (incluindo imagem de super-resolução e imagem de moléculas únicas), juntamente com melhorias contínuas nas técnicas de hibridação fluorescente in situ multicolorida, a nossa compreensão da estrutura e funções das células e tecidos cresceu exponencialmente. Simultaneamente, a evolução das tecnologias de sequenciação permitiu análises quantitativas e qualitativas precisas da expressão génica em células ou tecidos anteriormente inexplorados. A transcriptómica espacial, ao integrar tecnologias de imagem microscópica e de sequenciação, retém o máximo de informação espacial da amostra possível enquanto obtém dados sobre a expressão génica. Isso oferece aos cientistas descobertas revolucionárias com profundas implicações.

Sequenciação de Transcriptómica Espacial FFPE

Com o contínuo avanço e inovação na tecnologia de transcriptómica espacial, numerosos desafios técnicos estão a ser gradualmente superados. Recentemente, a 10X Genomics alcançou um avanço significativo ao aplicar a transcriptómica espacial para abordar com sucesso as limitações das secções de tecido fixadas em formalina e embebidas em parafina (FFPE) na análise da expressão genética espacial. Este desenvolvimento fornece um suporte robusto para a exploração adicional da informação espacial. A tecnologia de expressão genética espacial Visium combina de forma inteligente a histologia com sequenciação de RNA de alto rendimento, alargando significativamente os tipos e o alcance do processamento de amostras na tecnologia de sequenciação de células únicas. Isso proporciona uma seleção mais rica para a pesquisa em áreas como a fisiopatologia, permitindo análises transcriptómicas abrangentes de mais de 18.000 genes em humanos e em ratos. Esta tecnologia permite a investigação aprofundada da expressão genética de qualquer via, a análise da heterogeneidade tecidual e a revelação de tipos e estados celulares em diferentes contextos morfológicos de tecido.

Serviço de Sequenciação de Transcritos Espaciais Visium 10x Genomics na CD Genomics

O Serviço de Sequenciação de Transcriptómica Espacial da CD Genomics é uma técnica inovadora, utilizando a avançada plataforma 10x Visium, que permite o perfilamento transcricional in-situ preciso da expressão genética completa dentro dos tecidos. Esta abordagem fornece informações detalhadas não apenas sobre os níveis de expressão genética, mas também localiza precisamente onde os genes são expressos dentro do espaço do tecido. Este procedimento permite-nos observar e comparar diretamente as expressões genéticas diferenciais em várias regiões funcionais dentro dos tecidos. Ao fazê-lo, oferece uma ferramenta poderosa para a exploração aprofundada das funções dos tecidos e da mecânica das doenças, ampliando assim a nossa capacidade de investigar a mecânica da saúde e da doença.

10x Genomics

Princípio de Sequenciação de Transcriptómica Espacial Visium da 10x Genomics

A chave da tecnologia por trás das soluções de expressão gênica espacial reside na seção do slide. Servindo como base para a construção da biblioteca, cada slide é padronizado com quatro áreas de captura precisas, cada uma medindo 6,5 x 6,5 milímetros e exibidas em uma moldura quadrangular. Aninhados dentro de cada área de captura estão 5000 pontos etiquetados com códigos de barras, cada um com um diâmetro de 55 micrómetros e uma distância centro a centro de 100 micrómetros entre pontos adjacentes. Cada ponto possui uma sequência de código de barras única – um código de barras espacial – utilizado para identificar e diferenciar os pontos discretos. Além disso, cada sonda de ácido nucleico dentro de um ponto tem uma etiqueta única exclusiva para distinguir transcritos variados dentro de uma única célula e eliminar duplicações de PCR, alcançando assim a quantificação absoluta.

Após a libertação do RNA das células na secção de tecido, este migra para cada um dos locais mencionados e é atribuído a sequências de código de barras correspondentes. Subsequentemente, o RNA passa pelos processos de construção de biblioteca e sequenciação. Aproveitando a informação do código de barras dos dados da sonda, podemos alocar os dados com precisão ao seu local relevante, estabelecendo as origens dos dados a partir de coordenadas espaciais específicas. Em última análise, este processo permite a visualização da expressão gênica espacial.

Visão geral do fluxo de trabalho de análise espacial do Visium. (Dmitrii Shek et al,. Métodos Protoc. 2023)

Passos Experimentais de Sequenciação de Transcriptómica Espacial

A fatia de precisão de amostras de tecido fresco-congelado é realizada, seguida pela visualização utilizando técnicas de imagem avançadas.

As secções de tecido são posicionadas numa lâmina especialmente concebida, revestida com sondas de captura específicas para RNA. Após etapas rigorosas de fixação e permeabilização, o mRNA dentro das células é garantido que seja totalmente liberado e especificamente ligado às sondas de captura, levando a uma captura precisa da informação sobre a expressão génica.

O RNA capturado serve como o molde para a síntese precisa de cDNA e preparação da biblioteca de sequenciamento, garantindo a precisão e fiabilidade da análise subsequente.

As bibliotecas de sequenciamento preparadas passam por um sequenciamento eficiente para uma captura abrangente da informação de expressão génica.

Através da análise de visualização de dados, determinamos precisamente os genes que estão expressos, quantificamo-los e interpretamos ainda a sua informação de posicionamento espacial.

Fluxo de Trabalho do Serviço de Sequenciação de Transcriptómica Espacial

Fluxo de Trabalho do Serviço de Expressão Génica Espacial Visium para Tecidos Congelados Frescos

Fluxo de Trabalho do Serviço de Expressão Génica Espacial Visium para FFPE

Especificação do Serviço

	Requisitos de amostra Tecido Fresco: 6,5mm^3 FFPE: 6,5mm^3; DV200 > 50% Intervalo de Espécies: Humano, Rato, Rato. Para outras espécies, por favor consulte.
	Sequenciação Plataforma de Sequenciamento: Illumina NovaSeq 6000 Padrão de Sequenciação: Sequenciação PE150 Volume de Dados: ≥50k pares de leitura por local.
	Análise Bioinformática Fornecemos análises de bioinformática personalizadas, incluindo: Dados de sequência bruta Avaliação da qualidade dos dados de sequenciação e filtragem Controlo de qualidade pontual Alinhamento de dados Padronização de dados Agrupamento de pontos Análise de subpopulação de pontos Análise de marcadores Identificação de tipo celular Anotação da região anatómica Análise da comunicação celular Análise diferencial inter-amostral Análise diferencial da região de inter-anotação

Preparação de Amostras

É imperativo mencionar uma precaução crucial no processo de preparação de amostras, especificamente para amostras de tecido. É aconselhável evitar o congelamento rápido em nitrogênio líquido, uma vez que o resfriamento rápido pode potencialmente causar danos às estruturas celulares. Em vez disso, o uso de pentano embebido com OTC para o congelamento rápido de amostras de tecido é oficialmente recomendado pela 10X Genomics. Ao longo da aplicação prática, muitos pesquisadores frequentemente encontram dificuldades na etapa de preparação da suspensão durante experimentos de célula única. Apesar de várias tentativas de processamento de digestão, obter uma suspensão de célula única que atenda aos requisitos para uso em máquinas continua a ser árduo. Mesmo que alguém prossiga com a operação da máquina relutantemente, podem haver riscos de condições celulares subótimas, captura insuficiente de células e a complicação de confusão multicelular. Comparativamente, o fluxo de trabalho dos experimentos de transcriptómica espacial é algo mais simplificado. Sob a orientação de empresas conceituadas, após realizar um congelamento razoável das amostras de tecido, os passos subsequentes de clarificação do tecido, coloração, fixação, clarificação, construção de bibliotecas, sequenciação e análise, etc., podem ser confiados a empresas profissionais. Isso poderia poupar aos pesquisadores uma quantidade considerável de tempo.

Vantagens do Serviço

Corte de Qualidade SuperiorCom ampla experiência em corte e montagem, desenvolvemos soluções otimizadas para diferentes tecidos.

Análise AutomatizadaO nosso procedimento de análise bem estabelecido oferece uma interpretação rápida e precisa dos dados de transcriptoma espacial.

Controlo de Qualidade PadronizadoA nossa vasta experiência prática levou ao desenvolvimento de um sistema de controlo de qualidade padronizado.

Equipa ProfissionalA nossa renomada equipa técnica tem anos de experiência em design de planos de projeto, operações de laboratório e análise pós-venda.

Abordagem de Serviço CompletoOferecemos uma gama abrangente de serviços que abrange a criopreservação de tecidos e a incorporação, montagem, corte, desobstrução, construção de bibliotecas e sequenciação, bem como a análise de dados.

Figura 1. Agrupamento de pontos e integração de imagem. (Fonte: 10x Genomics)

Figura 2. Padrão de expressão génica em resolução espacial. (Fonte: 10x Genomics)

Figura 3. Expressão de mRNA e mapa de agrupamento do transcriptoma espacial. (Fonte: 10x Genomics)

• 1. Que tipos de materiais de tecido podemos processar?
  • Principalmente, a nossa solução de Expressão Génica Espacial Visium facilita a análise de amostras de tecido humano e de rato, particularmente aquelas em forma de bloco ou fixadas em lâminas de vidro, quer estejam coradas ou não coradas.
• 2. Qual é o tamanho das posições individuais no Slide Espacial Visium?
  • Os diâmetros das manchas medem 55 µm.
• 3. A Visium oferece uma abordagem para resolução a nível de célula única?
  • Embora cada ponto de 55 µm na nossa configuração atual do Visium capture aproximadamente 10 células, a nossa estratégia de bioinformática permite-nos desconvoluir os dados para exame a nível de célula única.
• 4. Como é organizada a área de captura no Slide Espacial Visium?
  • As configurações disponíveis para a área de captura são 6,5mm x 6,5mm ou 11mm x 11mm.

A mapeamento espacial revela subpopulações de adipócitos humanos com sensibilidades distintas.

Revista: Metabolismo Celular

Fator de impacto: 27,287

Publicado: 7 de setembro de 2021

Fundo

O tecido adiposo branco (TAB) regula o equilíbrio energético através do armazenamento de lipídios e da secreção de fatores. A sua plasticidade envolve vários tipos celulares, sendo que a expansão saudável do TAB necessita de vascularização, formação de adipócitos e respostas imunes, enquanto o TAB não saudável apresenta hipertrofia e inflamação crónica, levando a doenças metabólicas. A transcriptómica espacial combinada com sequenciação de RNA de célula única identificou três populações distintas de adipócitos no TAB humano, cada uma com diferentes respostas hormonais, destacando a importância da heterogeneidade dos adipócitos na sensibilidade hormonal.

Materiais e Métodos

Resultados

Utilizando a plataforma de Expressão Génica Espacial Visium da 10x Genomics, os autores analisaram o tecido adiposo subcutâneo abdominal de dez indivíduos. Identificaram 20 classes celulares distintas, incluindo células imunes, vasculares e progenitoras. A combinação de transcriptómica espacial e sequenciação de RNA de célula única revelou três classes de adipócitos maduros com assinaturas génicas únicas. Estas descobertas destacam a heterogeneidade celular e a organização espacial dentro do tecido adiposo, aumentando a compreensão da sua estrutura e função complexas.

Figura 1. Análises integrativas de dados transcriptómicos espaciais e de célula única identificam 18 classes celulares distintas no tecido adiposo humano.

Os autores analisaram sistematicamente a organização celular do tecido adiposo branco (WAT) e descobriram que as células formam tanto aglomerados homotípicos como heterotípicos. Células imunes, progenitores de adipócitos e células vasculares exibiram diferentes graus de aglomeração homotípica. Além disso, o estudo revelou relações espaciais entre diferentes classes celulares. Estas descobertas destacam as complexas e espacialmente definidas relações célula-célula dentro do WAT.

Figura 2. As células residentes do WAT apresentam grandes variações na propensão a formar aglomerados celulares homotípicos.

Figura 3. Populações celulares específicas exibem clusters heterotípicos no tecido adiposo branco (WAT).

Conclusão

Os autores utilizaram transcriptómica espacial de alta resolução para mapear o tecido adiposo branco humano (WAT), identificando 18 classes celulares distintas, incluindo progenitores de adipócitos, células imunes, vasculares e adipócitos maduros. Desenvolveram algoritmos para descobrir clusters celulares homotípicos e heterotípicos, mostrando que o WAT é mais organizado estruturalmente do que se pensava anteriormente. Notavelmente, descobriram que apenas uma das três populações de adipócitos maduros identificadas respondeu significativamente ao estímulo hormonal. Este trabalho aprimora a nossa compreensão da arquitetura celular do WAT e do seu impacto na sensibilidade hormonal, proporcionando um recurso valioso para futuras pesquisas.

Referência

1. Bäckdahl J, Franzén L, Massier L, et al. O mapeamento espacial revela subpopulações de adipócitos humanos com sensibilidades distintas. Metabolismo celular, 2021, 33(9): 1869-1882. e6.