2b-RAD

A CD Genomics está agora a fornecer sequenciação 2b-RAD, que é um método inovador de sequenciação de genoma completo de representação reduzida e sequenciação de DNA associada a locais de restrição (RAD) para mapeamento de ligação e determinação de variantes em todo o genoma de forma económica.

Qual é o Método 2b-RAD?

O método 2b-RAD (IIB-RAD), inicialmente descrito por Wang et al. em 2012, representa uma abordagem de ponta em alta capacidade de processamento. Genotipagem de SNPs. Utilizando endonucleases de restrição do tipo IIB, como Bcg I, esta técnica gera fragmentos de ADN uniformes variando entre 33 a 36 pares de bases, ao cleavar em locais de reconhecimento específicos. Isto elimina a necessidade de etapas de seleção de tamanho subsequentes. Uma das principais vantagens da metodologia 2b-RAD é a sua capacidade de produzir comprimentos de fragmentos consistentes em uma variedade de amostras, facilitando assim o sequenciamento preciso e eficiente e a subsequente descoberta de SNPs. Embora o método 2b-RAD produza menos fragmentos em relação às abordagens RAD de enzima única, ele compensa com uma resolução e cobertura superiores. Consequentemente, esta técnica aborda várias limitações inerentes presentes em métodos anteriores, como RAD-Seq e GBS, oferecendo uma alternativa robusta para uma análise abrangente de SNP.

Introdução ao 2b-RAD

O método 2b-RAD utiliza enzimas de restrição tipo IIB (REs), como a Bcg I, que clivam o ADN genómico de ambos os lados dos seus locais de reconhecimento para gerar fragmentos de ADN de dupla cadeia (dsDNA) de tamanho fixo com extremidades salientes e não coesivas. Subsequentemente, estes fragmentos de ADN são capturados utilizando um adaptador biotinilado específico para a enzima inicial. Em comparação com métodos análogos, como o ADN associado a locais de restrição (RAD) e genotipagem por sequenciação (GBS), a técnica 2b-RAD oferece uma especificidade superior para regiões de interesse, ao mesmo tempo que minimiza a geração de sequências de regiões não informativas e repetitivas.

A geração consistente de etiquetas curtas e uniformes através do método 2b-RAD oferece múltiplas vantagens, incluindo a cobertura de todos os locais de restrição, profundidade de sequenciação uniforme entre os locais, alta reprodutibilidade para medições quantitativas, redução dos custos de sequenciação por etiqueta e menor sensibilidade à degradação do ADN. Além disso, para aproveitar as capacidades de sequenciação aprimoradas de sequenciação de próxima geração (NGS) plataformas, integramos um protocolo avançado que permite a preparação de cinco etiquetas isoRAD concatenadas para sequenciação Illumina de extremidades pareadas (PE) de 150 bp. Este protocolo concede aos investigadores maior versatilidade e eficiência na conceção de configurações de bibliotecas adaptadas a objetivos de investigação específicos.

Vantagens do Nosso Serviço 2b-RAD

• Caracterizado por uma considerável flexibilidade, o número de etiquetas é controlável.
• As etiquetas exibem comprimentos consistentes, garantindo uma eficiência de amplificação uniforme durante a PCR.
• Estas etiquetas demonstram especificidade posicional, independentemente de sequências de referência e resultados de montagem.
• Além de utilizar marcadores co-dominantes como SNPs, também podem ser utilizados marcadores dominantes.
• Preciso e acessível
• Número de etiqueta flexível
• Comprimento de rótulo consistente
• Alta densidade de marcadores
• Não requerendo etapas de purificação intermédia.
• Permitir uma baixa entrada de ADN e ADN degradado
• Bibliotecas 2b-RAD altamente reduzidas requerem muito menos sequenciação para genotipagem precisa.

Aplicações do 2b-RAD

• Construção de Mapa Bin e Localização de QTL
• Genética populacional estudo
• Evolução populacional análise
• Estudo de associação em todo o genoma
• Filogenia do genoma
• Seleção genómica
• Mapeamento de ligação e associação
• Discriminação de estirpes microbianas
• Deteção de mutações somáticas

Fluxo de Trabalho 2b-RAD

O fluxo de trabalho geral para 2b-RAD inclui preparação de amostras, preparação da biblioteca 2b-RAD, sequenciação de alto rendimento e análise bioinformática. A nossa equipa de especialistas altamente experientes executa a gestão de qualidade, seguindo cada procedimento para garantir resultados confiáveis e imparciais. A construção da biblioteca para 2b-RAD consiste em quatro etapas principais (digestão com BsaXI, ligação, amplificação e codificação).

Especificações do Serviço

	Requisitos de Amostra DNA genómico ≥200 ng, Quantidade Mínima: 50 ng, concentração ≥5 ng/µL As amostras de ADN requerem um OD260/280 o mais próximo possível de 1,8~2,0. Todo o DNA deve ser tratado com RNase e não deve apresentar degradação ou contaminação. Nota: Os montantes de amostra são apresentados apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.
Clique	Estratégia de Sequenciamento Illumina HiSeq X dez, PE 150 Densidade média do rótulo do genoma: 2 kb A profundidade média do rótulo ≥ 20X Precisão de classificação ≥ 95%
	Análise Bioinformática Fornecemos várias análises de bioinformática personalizadas: Controlo de qualidade de dados brutos Análise estatística Genotipagem de SNPs Anotação do locus SNP Construção de mapa de ligação genética Estudos populacionais Nota: Os dados de saída recomendados e os conteúdos de análise exibidos são apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes em 2b-RAD para a sua escrita (personalização)

A CD Genomics tem o prazer de oferecer tecnologia de sequenciamento 2b-RAD de ponta, proporcionando um serviço abrangente que abrange todo o fluxo de trabalho, desde o controlo de qualidade do DNA genómico até à determinação de genótipos e à avaliação da diversidade populacional. Convidamo-lo a entrar em contacto connosco caso tenha necessidades ou perguntas específicas sobre os nossos serviços. Como fornecedor licenciado desta tecnologia avançada, a CD Genomics assegura conformidade e excelência na entrega de soluções genómicas robustas. É importante notar que a Keygene N.V. detém as patentes e pedidos de patente que protegem a propriedade intelectual associada às tecnologias de Genotipagem Baseada em Sequência.

Os resultados parciais estão mostrados abaixo:

Quais são as vantagens do 2b-RAD?

A CD Genomics tem o orgulho de oferecer uma tecnologia avançada de sequenciamento 2b-RAD, que possui inúmeras vantagens em relação à original. RAD-seq e GBSA comparação entre diferentes métodos de sequenciação do genoma completo com representação reduzida está delineada na Tabela 1.

Tabela 1. Comparação técnica entre 2b-RAD e outros métodos de genotipagem de representação reduzida baseados em NGS.

2. Quais são as desvantagens do 2b-RAD?

Embora o 2b-RAD seja um método poderoso para alta capacidade de processamento genotipagem, também tem algumas desvantagens. O 2b-RAD funciona apenas em espécies diploides. Além disso, as etiquetas curtas podem não ser longas o suficiente para a discriminação de locos em genomas complexos.

3. Como é preparada a biblioteca 2b-RAD?

A construção da biblioteca para 2b-RAD consiste em quatro etapas principais (digestão com BsaXI, ligadura, amplificação e codificação). Após a digestão do DNA pelo BsaXI, adaptadores são ligados aos fragmentos através de extremidades coesivas, e códigos de barras específicos são incorporados em cada amostra através da amplificação por PCR utilizando ligadores degenerados. Em seguida, os construtos de etiqueta única são produzidos usando adaptadores modificados e primers marcados com biotina, que podem ser posteriormente digeridos por SapI para gerar extremidades coesivas distintas e, em seguida, ligados numa ordem predefinida para produzir cinco etiquetas concatenadas. As amostras são então agrupadas e sequenciadas utilizando a tecnologia Illumina.

Figura 1. Visão esquemática do procedimento 2b-RAD.

4. O 2b-RAD consegue detectar SNP em regiões repetitivas?

O 2b-RAD pode não detectar SNP em regiões repetitivas que incluem um pequeno número de locais de restrição.

5. Quantos indivíduos são necessários para a construção de um mapa de ligação?

São necessárias pelo menos mais de 100 pessoas para a construção. mapa de ligação genética.

6. Para populações naturais, quantas amostras são necessárias?

As populações naturais geralmente têm mais SNP. O número de amostras depende do fenótipo de interesse, variando de dezenas a centenas de amostras. Quanto mais amostras você enviar, mais precisos serão os resultados de genotipagem.

7. Qual é o requisito para as espécies?

Os diploides com ou sem um genoma de referência são adequados para 2b-RAD. No entanto, os poliploides para 2b-RAD é melhor que tenham um genoma de referência, e ainda existem riscos.

Um mapa de ligação genética de alta resolução e mapeamento fino de QTL para características relacionadas ao crescimento e sexo no carpa comum do rio Yangtze.Cyprinus carpio haematopterus)

Revista: BMC Genomics

Publicado: 02 de abril de 2018

Fundo

Os autores construíram uma alta resolução mapa de ligação genética utilizando 7820 2b-RAD e 295 marcadores microsatélites numa família F2 de carpa comum do rio Yangtze (C. c. haematopterus). Eles mapearam um conjunto de QTLs sugestivos e significativos para características relacionadas com o crescimento e sexo neste mapa de ligação. O mapa genético e estes genes e marcadores candidatos derivados de QTL são úteis para estudos adicionais sobre a carpa comum do rio Yangtze.

Materiais e Métodos

Resultados

1. Construção do mapa de ligação de alta resolução

Um total de 8115 marcadores (7820 marcadores 2b-RAD e 295 SSRs) foram agrupados em 50 LGs que eram consistentes com o número haploide de cromossomas, utilizando o software JoinMap 4.1.

Figura 1. O mapa de ligação genética médio entre sexos da carpa comum do rio Yangtze C.c. haematóptero construído com base em marcadores 2b-RAD e microssatélites.

2. Mapeamento genómico comparativo

Figura 2. Diagrama Circos representando relações sinténicas entre C. c. haematopterus (direita) e (a e b) C. c. carpa (esquerda) e Danio rerio e (d) diagramas de Venn descrevendo sobreposições entre marcadores alinhados de forma única que foram mapeados para o genoma de C. c. carpa (Cc), D. rerio (Dr) e C. idellus (Ci).

3. Mapeamento QTL fino para características relacionadas com o crescimento e sexo.

Um total de 21 QTLs associados a características relacionadas com o crescimento foram detectados em 12 LGs, incluindo dois QTLs significativos em todo o genoma e 19 QTLs significativos a nível de cromossoma.

Figura 3. Um rastreio genómico dos perfis de LOD para (a) comprimento total, (b) comprimento do corpo, (c) altura do corpo, (d) comprimento da cabeça, (e) peso do corpo e (f) sexo em C. c. haematópteroAs linhas tracejadas e sólidas indicam os limiares de significância a nível de cromossoma e a nível de genoma.

4. Genes candidatos potenciais para o crescimento

Figura 4. A região QTL para características de crescimento no LG27 de C. c. hasematopterus e a sua região homóloga em genomas de D. rerio e C. idellus.

Referência

1. Feng X, Yu X, Fu B, et al.Um mapa de ligação genética de alta resolução e mapeamento fino de QTL para características relacionadas ao crescimento e sexo no carpa comum do rio Yangtze.Cyprinus carpio haematopterus). BMC Genomics, 2018, 19(1): 230.