Serviço de RAD-seq

O RAD-seq oferece uma forma económica de descobrir variações genéticas e construir mapas genéticos. A CD Genomics fornece técnicas avançadas de RAD-seq, incluindo dd-RAD e 2b-RAD, para oferecer insights genómicos de alta qualidade adaptados às suas necessidades de investigação.

O que é RAD-Seq

A sequenciação de DNA associada a sítios de restrição (RAD-seq) é um método robusto para analisar DNA genómico em sítios reconhecidos por endonucleases de restrição específicas. Originalmente introduzido por Baird et al. em 2008, a abordagem tradicional de RAD-seq envolve uma digestão de DNA genómico com uma única enzima de restrição, seguida pela adição de adaptadores e subsequente fragmentação aleatória desses fragmentos através de sonicação. Esta metodologia produz principalmente sequências de leitura 1 que se alinham precisamente com os sítios de reconhecimento da enzima, enquanto as sequências de leitura 2 exibem uma variabilidade considerável devido à fragmentação aleatória.

O RAD-seq oferece vantagens substanciais em estudos envolvendo espécies sem um genoma de referência. Um dos seus principais benefícios é a redução significativa nos custos de sequenciação em comparação com sequenciação do genoma completo, ao mesmo tempo que fornece uma riqueza de dados de variação em todo o genoma. Estas características tornam o RAD-seq particularmente valioso em diversas aplicações, como o desenvolvimento de marcadores moleculares, a construção de mapas genéticos, o mapeamento de genes e de loci de características quantitativas (QTL), estudos de associação genoma inteiro (GWAS), genética populacionale melhoramento molecular.

Variações do RAD-seq, incluindo o RAD de digestão dupla (dd-RAD), 2b-RAD, e o fragmento amplificado de locus específico-RAD (SLAF-RAD), foram desenvolvidos para atender a diferentes necessidades experimentais. As diferenças entre estas técnicas envolvem principalmente o número de enzimas utilizadas, a presença ou ausência de etapas de fragmentação aleatória e o design de adaptadores com ou sem códigos de barras. Apesar dessas variações, o princípio fundamental permanece consistente: todas envolvem a digestão do genoma com enzimas de restrição e a sequenciação dos fragmentos resultantes.

• dd-RADEste método utiliza uma combinação de enzimas de restrição raras e frequentes para digerir o genoma, eliminando a necessidade de uma etapa de fragmentação subsequente. Permite um controlo mais preciso sobre o tamanho dos fragmentos e produz resultados reproduzíveis.
• 2b-RADUtiliza enzimas de restrição tipo IIB, que produzem fragmentos de ADN de tamanho uniforme. Esta uniformidade simplifica os processos subsequentes e melhora a consistência e comparabilidade dos resultados.
• SLAF-RADPartilha semelhanças com dd-RAD na etapa de digestão, mas utiliza adaptadores não específicos durante a preparação da biblioteca. Esta abordagem visa equilibrar a especificidade com a flexibilidade em diferentes configurações experimentais.

Figura 1. Ilustração passo a passo de cinco protocolos de preparação de bibliotecas RAD-seq. (Andrews et al., 2016)

Para que é utilizado o RAD-Seq?

RAD-seq é uma ferramenta versátil utilizada em uma variedade de aplicações genómicas:

• Desenvolvimento de Marcadores Moleculares: Utilizado para descobrir marcadores genéticos essenciais para programas de melhoramento e investigação genética.
• Mapeamento Genético: Facilita a criação de alta densidade mapas de ligação genética, permitindo uma análise detalhada da ligação genética e dos padrões de herança.
• Mapeamento de Genes/QTL: Ajuda a identificar QTL e genes específicos associados a características particulares.
• GWAS: Ajuda a identificar variantes genéticas ligadas a características ou doenças complexas dentro de populações.
• Análise de Genética Populacional: Permite a análise da diversidade genética, estrutura populacional e relações evolutivas entre indivíduos e espécies.

Vantagens do Nosso Serviço de RAD-Seq

• Fornece a distância genética total do mapa e é responsável pela localização de traços para os clientes.
• Fornece aos clientes texto para a seção de métodos dos seus artigos, bem como tabelas e figuras relacionadas ao projeto.
• Estratégia de preços flexível.
• Experiência extensa na análise de genomas de grandes animais e plantas.
• Integração de análises genómicas abrangentes, oferecendo vários serviços de tecnologia ómica, incluindo genómica, transcriptómica e epigenética, bem como soluções avançadas e personalizadas de análise genómica.
• Processos simplificados com ciclos de projeto mais curtos.
• Economia de custos através da análise conjunta de informações de amostras com bases de dados públicas.

Fluxo de Trabalho RAD-Seq

O RAD-seq envolve uma série estruturada de etapas, incluindo:

• Fragmentação de DNA genómico utilizando endonucleases de restrição.
• Adaptadores P1 adjacentes ao DNA fragmentado.
• Agregando e fragmentando aleatoriamente segmentos clivados por enzimas de todas as amostras.
• Corte de fragmentos de dimensões apropriadas (tipicamente na faixa de 300 a 700 pares de bases).
• Ligação de adaptadores P2 aos fragmentos selecionados.
• Implementação da amplificação por PCR para enriquecimento.

O fluxo de trabalho do RAD-Seq na CD Genomics envolve várias etapas-chave:

Especificações do Serviço

As especificações do nosso serviço abrangem principalmente três aspetos: Requisitos de Amostra, Estratégia de Sequenciação e Análise Bioinformática.

Requisitos de Amostra

1. Detecção de Variantes:

Quantidade da amostra de DNA: ≥ 3 µg.

Digestão com EcoRI (GAATTC).

Profundidade de sequenciação recomendada: ≥ 1X por amostra (≥ 5X para amostras de montagem).

2. Mapeamento Genético:

Quantidade da amostra de ADN: ≥ 3 µg.

Profundidade de sequenciação: Pais 2-5X, Descendência 0,8X por indivíduo (F1, F2, etc., populações temporárias), 0,6X por indivíduo (RIL, DH, etc., populações permanentes).

Aplicável a: Espécies haploides ou diploides, todas as populações de mapeamento (F1, F2; RIL, DH, etc.), com populações de 100 indivíduos ou mais.

3. Evolução da População:

Quantidade de amostra de DNA: ≥ 3 µg.

Profundidade de sequenciamento: ≥ 1X por indivíduo (≥ 5X para amostras de montagem).

Aplicável a: Diferentes subpopulações dentro de espécies haploides ou diploides, divisões distintas de subpopulações, indivíduos representativos dentro da mesma subpopulação. Aproximadamente 10 amostras por subpopulação (para animais ≥ 10, para plantas ≥ 15), com um total de pelo menos 30 amostras.

4. Detalhes da Amostra:

Amostras de DNA: Por favor, forneça DNA com uma concentração > 100 ng/μl e uma quantidade total > 3 μg, relação OD 260/280 entre 1.8 e 2.0.

Assegure-se de que o ADN não está degradado, não apresenta bandas significativas de ARN durante a eletroforese e tem bandas genómicas claras e intactas, com a banda principal acima de 100 kb. A contaminação por polissacarídeos ou glicoproteínas pode representar desafios significativos para a fragmentação do ADN, tornando a remoção difícil. Portanto, é essencial que as amostras fornecidas estejam livres de contaminação por polissacarídeos ou glicoproteínas.

Amostras de plantas: Selecione tecidos jovens da planta, com cada amostra a pesar > 500 mg. Armazene e envie as amostras em gelo seco ou em nitrogénio líquido.

Amostras de animais: São necessários tecidos animais frescos, evitando tecidos gordurosos, com cada amostra a pesar > 50 mg.

Para espécies comuns, selecione tecidos como fígado, rim e sangue. Para espécies raras, forneça amostras de orelha ou amostras de cabelo (com raízes) com menor teor de gordura. Para minimizar o impacto da variação individual na montagem subsequente, é preferível amostrar do mesmo indivíduo. Se as espécies forem pequenas em tamanho e a quantidade de extração de DNA de um único indivíduo for insuficiente para sequenciação, tente reduzir o número de indivíduos amostrados, mantendo a quantidade necessária. Forneça amostras de tecido de > 50 mg; forneça uma quantidade suficiente, considerando que diferentes espécies podem produzir quantidades variadas de DNA durante a extração.

Nota: As quantidades de amostra são listadas apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.

Estratégia de Sequenciamento

Análise Bioinformática

• Desenvolvimento de Marcadores Moleculares: Identificação de SNPs individuais, identificação de marcadores InDel individuais, integração de marcadores SNP populacionais.
• Mapeamento Genético de Alta Densidade: Diferenciação de grupos de ligação, ordenação de um grande número de marcadores e triagem de loci de segregação enviesada.
• Análise de Genética de Populações: Realização de análises genéticas populacionais de dados de SNP, incluindo construção de árvores, análise de estrutura populacional e análise de PCA.
• Mapeamento de Esboços Genómicos: Montagem de esboços genómicos e anotação de genes.

Nota: Os dados recomendados e os conteúdos de análise exibidos são apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes em RAD-seq para a sua escrita (personalização)

Referência

1. Andrews KR, Good JM, Miller MR, et al. Aproveitando o poder do RADseq para a genómica ecológica e evolutiva. Nature Reviews Genetics. Fevereiro de 2016;17(2):81-92.

Resultados da Demonstração

Os resultados parciais estão mostrados abaixo:

Perguntas Frequentes sobre RAD-seq

Q: Quais considerações são fundamentais no desenvolvimento de marcadores SNP de alta densidade?

A: Os pré-requisitos essenciais e os princípios orientadores para o desenvolvimento de marcadores SNP de alta densidade giram em torno da necessidade imperativa de alcançar uma distribuição equilibrada de fragmentos por todo o genoma. Ao identificar sequências que representam fielmente informações genómicas abrangentes, uma gama de milhares de marcadores SNP pode ser gerada de forma sistemática. Nas fases iniciais, técnicas de bioinformática são empregues para avaliar metódicamente o genoma de referência da espécie-alvo (ou sequências BAC conhecidas). Guiados por fatores como o conteúdo de GC do genoma, características de sequências repetitivas e atributos de genes, são feitas escolhas discernidas de enzimas de restrição apropriadas e tipos de bibliotecas de sequenciamento, com o objetivo principal de garantir que a densidade, consistência e eficácia geral dos marcadores moleculares estejam alinhadas com os rigorosos requisitos da análise genética e da melhoramento molecular.

Q: Quais são os domínios de aplicação do RAD-seq?

A: O RAD-seq encontra uma utilidade versátil em diversas áreas de investigação, abrangendo o estabelecimento de mapas genéticos, a análise filogeográfica de polimorfismos, estudos de associação e mapeamento de QTL, independentemente da presença ou ausência de dados de genoma de referência para uma determinada espécie. O amplo alcance da tecnologia RAD-Seq estende-se a investigações envolvendo a descoberta de variações, a construção de mapas genéticos, a exploração de genes funcionais e o estudo da evolução populacional.

Quais são os méritos de empregar RAD-seq no contexto de estudos sobre a evolução populacional?

A: Evolução da população Os estudos normalmente abrangem um número considerável de espécimes. O RAD-seq apresenta um conjunto de vantagens distintas a este respeito. Diminui efetivamente a complexidade do genoma, resultando em menores despesas com a preparação de bibliotecas e sequenciação. O seu fluxo de trabalho simples simplifica o processo. Além disso, a sua independência em relação a genomas de referência torna-o aplicável a um espectro mais amplo de espécies. Notavelmente, o RAD-seq destaca-se em investigações que envolvem tamanhos de amostra extensos, proporcionando assim uma estrutura robusta para a extração abrangente de dados através de tecnologias de resequenciamento de genoma completo.

Q: O que distingue a utilização de um genoma de referência da sua ausência?

A: Quando se trata da identificação de informações mutacionais, a incorporação de um genoma de referência para alinhamento de sequências e deteção de variações geralmente resulta em níveis elevados de eficiência e precisão. Além disso, facilita a localização precisa de genes específicos e permite investigações sobre o desequilíbrio de ligação populacional.

Estudos de Caso de RAD-seq

Sequência do genoma e análise da glória da manhã japonesa Ipomoea nil

Revista: Nature Communications

Fator de impacto: 16,6

Publicado: 08 de Novembro de 2016

Fundo

Ipomoea é um grande gênero com espécies diversas, incluindo a I. nil (glória da manhã japonesa), que é comercialmente significativa. Os investigadores utilizaram Illumina e Sequenciação PacBio para montar um genoma de 750 Mb de I. nil, identificando transposões Tpn1 e mapeando o gene do nanismo, CONTRACTED.

Materiais e Métodos

Resultados

1. Sequenciação de DNA e Montagem do Genoma

Uma única planta de TKS foi sequenciada, revelando um genoma de 750 Mb. A sequenciação PacBio forneceu leituras longas e alta cobertura, que, combinadas com os dados da Illumina, produziram uma montagem com um N50 de 3,72 Mb. Uma montagem alternativa apenas com Illumina era maior, mas de qualidade inferior.

2. Detecção de Montagens Incorretas e Construção de Pseudo-moléculas

Os dados de RAD-seq ajudaram a corrigir montagens incorretas, levando a uma montagem melhorada. Foram construídos pseudo-cromossomas, cobrindo 91,42% do genoma com um N50 de 44,78 Mb.

Figura 1: Caracterizações genómicas de Eu. nada.

3. Validação da Montagem

A montagem foi validada através da análise CEGMA e BUSCO, mostrando alta completude, e suportada por alinhamentos com ESTs e sequências de extremidade de BAC, confirmando a sua qualidade.

4. Análise e Identificação de Tpn1 Transposões

O genoma continha 63,29% de elementos repetitivos, incluindo transposões Tpn1, alguns dos quais estavam ativos e associados a interrupções genéticas em mutantes.

Figura 2: O Tpn1 transposões familiares que codificam transposases.

5. Predição de Genes e Anotação Funcional

Foram preditos 42.783 modelos de genes, com 79,12% anotados, e os dados de RNA-seq forneceram insights funcionais.

6. Análise do Gene Anão CONTRATADO (CT)

O gene CT, associado ao nanismo e à biossíntese de BR, foi interrompido por inserções de transposões em mutantes, afetando a expressão gênica.

7. Evolução do Genoma

A análise filogenética revelou as relações próximas de I. nil com o tomate e o kiwi, com famílias de genes únicas e eventos de duplicação genómica (WGD) distintos da Solanaceae.

Figura 3: Evolução do genoma.

Conclusão

O estudo utilizou ferramentas de sequenciação avançadas para produzir uma montagem genómica de alta qualidade de Ipomoea nil, melhorando significativamente os comprimentos dos andaimes e a resolução de repetições. Identificou genes-chave e transposões relacionados com características e mutações das plantas, e destacou o impacto das duplicações de genoma completo na evolução das plantas. Este trabalho apoia futuras investigações e genómica comparativa na ordem Solanales.

Referência

1. Hoshino A, Jayakumar V, Nitasaka E, et al. Sequência do genoma e análise da glória da manhã japonesa. Ipomoea nil. Comunicações da Natureza. 2016, 8 de Nov;7(1):13295.