Sequenciação de Transcritos de Comprimento Completo com Nanoporos

A Introdução do Nanoporos

A complexidade das leituras curtas sequenciação de segunda geração a montagem de dados e a incapacidade de resolver de forma fiável sequências repetidas ou grandes rearranjos genómicos foram superadas pela terceira geração de sequenciação, que gera leituras muito longas (1–100kb), o que é distinto de sequenciação de próxima geração.

Em 2014, a Oxford Nanopore Technologies lançou sequenciação por nanoporo na forma do MinION, um sequenciador portátil que utiliza uma grelha de nanoporos biológicos embebidos em membrana. A membrana em que os nanoporos estão localizados proporciona a separação de duas soluções iónicas, permitindo que uma corrente elétrica flua através dos nanoporos. Moléculas de DNA longas são preparadas adicionando um adaptador em forma de gancho a uma extremidade da molécula de cadeia dupla antes que uma helicase e uma proteína motora ligadas ao molde desenrolem e passem o DNA de cadeia simples através do canal do nanoporo. O DNA pode ser avançado através do poro uma base de cada vez, com as bases nucleotídicas induzindo alterações características na corrente elétrica que passa pelo nanoporo, que são traduzidas em chamadas de base. Como o processo de sequenciação utiliza muito poucos reagentes esgotáveis, a corrida pode efetivamente continuar até que um resultado satisfatório seja alcançado.

Figura 1. Visão geral da sequenciação por nanoporo.

Vantagens da Sequenciação de Transcritos de Comprimento Total por Nanoporos

• O comprimento mapeável ligeiramente mais longo (> 2 Mb).
• O ONT MinION oferece um elevado rendimento, uma vez que os nanoporos podem sequenciar múltiplas moléculas.
• O custo para a geração de dados ONT é mais baixo.
• Quantificação precisa de isoformas: Diferenciação e identificação precisas de isoformas e novos transcritos; é reportada uma correlação de 98,9% entre as avaliações quantitativas e os valores teóricos.
• Ausência de viés de GC e PCR: Uma vez que o processo de preparação da biblioteca não inclui uma etapa de PCR, o viés de PCR é eliminado; além disso, não há viés de GC.
• Ampla gama de deteção de transcritos: Transcritos, geralmente abrangendo alguns milhares de nucleótidos, são detectáveis sem seleção de fragmentos, permitindo a identificação de transcritos que vão de dezenas a dezenas de milhares de nucleótidos.
• Deteção direta de variantes estruturais: A descoberta direta de splicing variável e genes de fusão é tornada possível.

Uma vez que o custo de sequenciação é um obstáculo significativo para a aplicação da TGS, a taxa de transferência relativamente alta e a acessibilidade tornam a ONT promissora para muitas aplicações.

Aplicação de Sequenciação de Transcritos de Comprimento Total com Nanoporos

• Desenvolvimento Embrionário
• Diferenciação Celular
• Proliferação Celular
• Atividade Neuronal
• Resposta Imune
• Formação de Tumores e Metástase

A sequenciação do transcriptoma completo por nanopore oferece diversas aplicações em várias áreas de investigação biológica, incluindo:

• Identificação de Novos Transcritos: Esta tecnologia ajuda na descoberta de novos transcritos e variantes de splicing sem necessitar de um genoma de referência.
• Análise da Estrutura Genética: Permite uma análise precisa das estruturas genéticas, incluindo limites de éxons e íntrons, regiões não traduzidas (UTRs) e caudas poliadeniladas.
• Deteção de Genes de Fusão e Splicing Alternativo: O sequenciamento do transcriptoma completo pode identificar diretamente genes de fusão e variantes de splicing, sendo particularmente benéfico para a investigação do cancro.
• Análise de Transcritos Eucarióticos: A tecnologia enriquece seletivamente os transcritos eucarióticos com caudas de poli-A durante a preparação da biblioteca, melhorando o seu estudo.
• Estudo de lncRNAs: Embora melhore principalmente lncRNAs com mRNA e caudas de poli-A, também fornece informações sobre a estrutura e função dos lncRNAs. No entanto, lncRNAs que não possuem caudas de poli-A não podem ser enriquecidos e permanecem indetectáveis.

Fluxo de Trabalho de Sequenciação de Transcritos de Comprimento Total com Nanoporos

Especificação de Serviço

	Requisitos de Amostra Espécies amostrais: Humano, Rato, Rato de laboratório RNA total ≥ 2 μg Certifique-se de que a sua amostra de RNA cumpra os seguintes critérios: Tamanho médio do fragmento: ~2 kb Massa de entrada, medida pelo ensaio Qubit RNA HS: 250 ng Uma relação de 260:280 de ~2,0 Uma proporção de 260:230 de 2.0-2.2 Sem detergentes ou surfactantes no tampão.
	Estratégia de Sequenciamento Plataformas ONT, Biblioteca: 8K, 2G/por amostra
	Análise Bioinformática Processamento de Leituras Longas da Oxford Nanopore Technologies Remover redundante Encontrar transcrito de fusão Análise de estrutura Predição de fatores de transcrição análise de lncRNA Anotação funcional de genes Chamadas de SNP Quantificação dos níveis de expressão de genes/transcritos e análise de expressão diferencial Análise de enriquecimento funcional IPP (Interacção Proteína-Protéina)

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciamento originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes na Sequenciação de Transcritos de Comprimento Total com Nanopore para a sua escrita (personalização)

Referência:

1. Weirather J L, Cesare M D, Wang Y, et al.Comparação abrangente entre a Pacific Biosciences e a Oxford Nanopore Technologies e as suas aplicações na análise do transcriptoma. F1000research, 2017, 6:100.

1. A sequenciação do transcriptoma em comprimento total requer fragmentação e montagem?

Sequenciação do transcriptoma em comprimento total, baseado em plataformas de sequenciação de terceira geração PacBio ou Nanopore, não requer fragmentação e montagem. Gera diretamente transcritos completos contendo UTRs 5' e 3' e caudas de poli-A. Esta abordagem permite uma análise precisa de eventos de splicing alternativo e fusão de genes em espécies com um genoma de referência, abordando os desafios de montagens de transcritos mais curtas e incompletas em espécies sem um genoma de referência.

2. Qual é a precisão da deteção de transcriptoma completo?

A taxa de erro base das plataformas de sequenciação de terceira geração é imparcial. Para a plataforma Nanopore, utilizar informações do genoma de referência para a correção de sequências pode melhorar significativamente a precisão da correção de bases.

3. A sequenciação do transcriptoma completo capta todos os lncRNAs?

Durante o processo de construção da biblioteca, são identificadas moléculas de RNA com estruturas de poli-A, enriquecendo mRNAs e alguns lncRNAs com caudas de poli-A a partir do RNA total. No entanto, lncRNAs sem estruturas de poli-A não podem ser enriquecidos e sequenciados desta forma, resultando na deteção apenas de um subconjunto de lncRNAs.

4. Quantos replicados biológicos são geralmente recomendados para o sequenciamento do transcriptoma completo com Nanopore?

A pesquisa indica que réplicas biológicas melhoram a precisão na identificação dos níveis de expressão génica em todo o transcriptoma, enquanto um aumento na profundidade de sequenciação melhora principalmente a precisão na deteção de genes com baixa expressão. Recomenda-se ter pelo menos três réplicas biológicas para cada condição de tratamento. Para estudos que envolvem amostras com alta variabilidade biológica ou que visam detectar diferenças sutis de expressão ou alterações em múltiplos, é necessário um número maior de réplicas biológicas. Por exemplo, amostras clínicas com diferenças individuais significativas podem exigir de 5 a 10 réplicas por grupo, enquanto amostras de linhas celulares com menor variabilidade biológica podem ser suficientes com três réplicas por grupo.

5. Quais são as diferenças entre o sequenciamento do transcriptoma completo por Nanopore e a segunda geração da Illumina? Sequenciação de RNA?

A principal diferença reside nas plataformas de sequenciação. A plataforma Illumina utiliza tipicamente sequenciação de extremidades pareadas 150 (PE150), construindo bibliotecas de pequenos fragmentos e realizando sequenciação por síntese, o que requer amplificação por PCR durante a preparação da biblioteca e a sequenciação. É utilizada principalmente para quantificar a expressão génica e a análise de expressão diferencial. Em contraste, a sequenciação do transcriptoma completo por Nanopore não requer fragmentação de RNA e pode capturar transcritos completos do 5' ao 3', fornecendo informações abrangentes sobre sequências e expressão. Não apresenta viés em relação ao tamanho dos fragmentos e deteta diretamente sinais elétricos, eliminando a necessidade de síntese durante a sequenciação e resultando em um viés de GC muito mais baixo em comparação com plataformas de segunda geração. Além disso, como não requer montagem de transcritos, possui vantagens significativas na deteção de variações estruturais a nível de transcritos, como splicing alternativo, fusões génicas, APA (poliadenilação alternativa) e previsão de novos genes.

Caracterização do transcript completo de SF3B1 a mutação na leucemia linfocítica crónica revela a desregulação de intrões retidos

Revista: Comunicações da Natureza
Fator de impacto: 14,919
Publicado: 18 de março de 2020

Fundo

Em vários tipos de câncer, mutações no fator de splicing SF3B1 têm estado associados a alterações específicas nos padrões de splicing, afetando condições como leucemia linfocítica crónica (LLC), melanoma uveal, cancro da mama e síndromes mielodisplásicos. SF3B1, um componente fundamental do spliceossoma, interage com o pré-mRNA e exerce um controlo crucial sobre o processo de splicing. Particularmente notáveis são as mutações em SF3B1, nomeadamente a mutação K700E, que têm sido correlacionadas com desfechos clínicos adversos na LLC. Embora o sequenciamento de leituras curtas tenha fornecido informações sobre padrões de splicing influenciados por SF3B1 As mutações, o sequenciamento de nanopore de leitura longa oferece uma perspectiva mais abrangente, revelando novos detalhes sobre alterações de splicing. Sequenciação por nanopore facilita a deteção de moléculas de transcritos de comprimento completo e permite a avaliação precisa de eventos de splicing alternativo, apresentando caminhos promissores para a investigação do câncer e intervenções terapêuticas.

Métodos

Resultados

Neste estudo piloto, os autores utilizaram sequenciação por nanoporo para analisar SF3B1^K700E transcrições completas em amostras de LLC. Os autores encontraram um aumento de splicing aberrante 3' em SF3B1^K700E, confirmando descobertas anteriores. Amostras adicionais foram sequenciadas utilizando tecnologia de nanopore, gerando 257 milhões de leituras no total. Apesar do armazenamento de RNA por 5 anos, foi observada uma degradação mínima. A forte correlação na expressão gênica entre as amostras sequenciadas pelo minION e pelo PromethION permitiu a combinação de dados para análises subsequentes.

Fig. 1: Sequenciação de nanoporo de leitura longa e análise FLAIR para identificar transcritos de comprimento completo associados a SF3B1 mutação na leucemia linfocítica crónica.

Neste estudo, os investigadores procuraram confirmar a amplificação da utilização de sítios de splicing alternativos 3' (3'SS) induzida por SF3B1^K700E dados de sequenciação por nanoporo. Foi realizada uma análise comparativa de eventos de splicing 3' em um coorte de leucemia linfocítica crónica (LLC), inicialmente identificados através de sequenciação de leitura curta da Illumina, juntamente com os resultados da sequenciação por nanoporo. Para classificar com precisão os eventos de splicing alternativo (AS) em isoformas, os autores criaram um chamador de eventos AS dentro do FLAIR. Esta abordagem facilitou a identificação de diferenças significativas nos locais de splice alternativos 3' e 5' entre SF3B1^K700E e SF3B1^WTObservações notáveis incluíram a identificação de uma região rica em adenina a montante do 3'SS canónico, alinhando-se com descobertas de pesquisas anteriores.

Fig. 2: Os padrões de splicing da Alternativa 3 identificados com dados de sequenciação por nanopore são concordantes com os dados de leituras curtas e revelam uma complexidade adicional de splicing.

Estudos de leitura curta têm associado mutantes SF3B1 na LLC para um aumento de transcrições com códon de terminação prematura (PTCs). O sequenciamento de cDNA de comprimento total permite uma deteção mais precisa de transcrições com PTCs e a estimativa de isoformas não produtivas. Isoformas não produtivas, definidas por PTCs localizados 55 nucleotídeos ou mais a montante da junção de splicing mais 3', podem sofrer retenção nuclear ou degradação mediada por nonsense. Nos dados de nanopore, os autores identificaram com precisão transcrições não produtivas conhecidas de SRSF1 e descobriram isoformas adicionais não anotadas, algumas das quais são previstas como não produtivas.

Fig. 3: Mutante SF3B1 regula negativamente transcritos não produtivos que retêm intrões.

Conclusão

Este estudo utiliza sequenciação por nanoporo para examinar cDNA de comprimento completo a partir de amostras de LLC, revelando eventos de splicing diferencial significativos associados a SF3B1 mutação. Os autores apresentam o FLAIR, um fluxo de trabalho computacional para a análise de transcritos, e identificam alterações nos locais de splicing 3' e a downregulação de eventos de retenção de íntrons. A análise de transcritos de comprimento completo fornece informações sobre splicing alternativo e abundância de isoformas, destacando o potencial da sequenciação por nanoporo para a investigação do câncer e do splicing.

Referência:

1. Tang, Alison D., et al."Caracterização do transcrito completo" SF3B1 "mutação na leucemia linfocítica crónica revela a desregulação de intrões retidos." Comunicações da Natureza 11.1 (2020): 1438.