Diretrizes para Submissão de Amostras
Por que a Sequenciação de Amplicões por Nanoporos é Importante
Métodos de leitura curta, como os painéis Illumina que visam as regiões V3–V4, muitas vezes falham em distinguir espécies estreitamente relacionadas. Isso pode limitar a pesquisa subsequente na análise do microbioma, deteção de patógenos e validação clonal.
A sequenciação por nanopore preenche essas lacunas ao produzir leituras longas ao longo de todo o comprimento do gene, como V1–V9 do 16S ou toda a região ITS. Estas leituras proporcionam uma maior resolução taxonómica, reduzem erros na análise da comunidade e permitem uma identificação confiante a nível de espécie ou estirpe.
Para investigadores que necessitam de um contexto mais amplo, Sequenciação Ultra-Longa por Nanoporos suporta montagens do genoma de telómero a telómero, enquanto Sequenciação de RNA Direta por Nanoporos estrutura de links com expressão.
Fluxo de trabalho para a abordagem de PCR em duas etapas na preparação de bibliotecas de sequenciamento de amplicões Nanopore. (Esta figura foi adaptada de Yoshiyuki Matsuo (https://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.8epv5zrodv1b/v4)
Especificações Técnicas
A CD Genomics oferece um fluxo de trabalho fiável e completo para Sequenciação de Amplicões por Nanoporos, optimizados tanto para projetos clonais como baseados em comunidades. Os nossos protocolos de laboratório, plataformas de sequenciação e pipelines de bioinformática são concebidos para maximizar a precisão de leitura e garantir a resolução a nível de espécie ou estirpe.
| Parâmetro | Especificação |
|---|---|
| Intervalo de tamanho do amplicão | 0,5–25 kb (suporte alargado disponível mediante solicitação) |
| Plataformas | Oxford Nanopore PromethION / GridION |
| Química | Kit 14 com células de fluxo R10.4.1 para maior precisão |
| Profundidade de leitura | ≥50.000 leituras por amostra recomendadas para perfilagem de comunidades |
| Tempo de resposta | 1–3 dias úteis (projetos clonais); ~14 dias (perfilamento comunitário) |
| Precisão dos dados | Pipelines de polimento padrão; fluxo de trabalho de consenso baseado em código de barras opcional para maior fidelidade. |
| Entregáveis | Ficheiros FASTQ/FASTA, relatórios de controlo de qualidade, tabelas de taxonomia/variantes, relatórios interativos em HTML e PDF |
Garantia de qualidadeTodos os projetos de sequenciação passam por um controlo de qualidade rigoroso, incluindo verificações da integridade do DNA, análise da distribuição do comprimento das leituras e monitorização da taxa de erros.
Aplicações
A sequenciação de amplicões por nanopore é amplamente aplicada em pesquisa microbianavalidação de genes e genómica comparativaAo fornecer leituras longas que abrangem amplificões inteiros, permite uma interpretação confiante de conjuntos de dados complexos e reduz a ambiguidade frequentemente encontrada em métodos de leituras curtas.
Perfilagem da Comunidade Microbiana
- Regiões completas de 16S rRNA (V1–V9) e ITS fornecem identificação a nível de espécie.
- Adequado para amostras ambientais, microbiomas humanos e projetos de microbiologia industrial.
- Suporta a análise de diversidade, avaliação da estrutura populacional e estudos comparativos.
Vigilância de Patógenos e Avaliação de Risco
- Detetar patógenos potenciais na água, solo, alimentos e ambientes interiores.
- Permite o rastreio de alterações microbianas em resposta a mudanças sazonais ou ambientais.
- Melhora a monitorização da biossegurança em investigação clínica e agrícola.
Segurança Alimentar e Agricultura
- Identificar organismos de deterioração e cepas benéficas nas cadeias de produção alimentar.
- Apoiar programas de reprodução através da caracterização de comunidades microbianas ligadas à resiliência das culturas.
- Facilitar estudos de biotecnologia agrícola resolvendo a diversidade a nível de estirpes.
Verificação Clonal e Detecção de Variantes
- Confirme amplicões de um único gene, construções editadas ou inserções de plasmídeos.
- Gerar consenso de alta fidelidade para amostras clonais utilizando estratégias baseadas em código de barras.
- A rápida resposta permite ciclos de design e teste iterativos.
Genómica Comparativa e Evolutiva
- Resolver espécies e variantes a nível de estirpe intimamente relacionadas.
- Apoiar estudos de genética populacional e evolução microbiana com cobertura completa.
- Combinar com Sequenciação de Alvo por Nanoporos para uma análise focada de loci específicos.
Fluxo de Trabalho: Serviço de Ponta a Ponta
Estratégia de primer: selecionar regiões-alvo (16S, ITS, genes personalizados)
PCR de alta fidelidade: com etiquetagem de código de barras opcional para correção de erros
Preparação da bibliotecaKit ONT 14, fragmentação mínima
SequenciaçãoPromethION/GridION com células de fluxo R10.4.1
Processamento de dados: chamada de base, geração de consenso, filtragem de quimeras
Bioinformáticaatribuição taxonómica, análise de variantes, estatísticas de diversidade
EntregaFicheiros FASTQ/FASTA, relatórios de QC, saídas em HTML/PDF
Bioinformática e Relatórios
A CD Genomics oferece um pipeline de bioinformática completo para Sequenciação de Amplicões por Nanoporos, garantindo resultados de alta confiança e saídas prontas para publicação. A nossa análise abrange controlo de qualidade, classificação taxonómica, deteção de variantes e relatórios personalizados.
Análise Padrão
Basecalling e demultiplexagemconversão de sinais brutos para FASTQ com separação de amostras.
Controlo de qualidadedistribuição do comprimento de leitura, profundidade de cobertura e estatísticas de precisão.
Atribuição taxonómicaclassificação a nível de espécie para conjuntos de dados de 16S e ITS utilizando bases de dados de referência curadas.
Análise de diversidadeíndices de diversidade alfa e beta com visualizações como gráficos de PCoA ou NMDS.
Análise Avançada (Opcional)
Abundância diferencialestatísticas comparativas entre grupos experimentais.
Deteção de variantesidentificar variantes de sequência dentro de amplicões clonais.
Fluxo de trabalho de consenso de código de barras: precisão aprimorada com supressão de erros e filtragem de quimeras.
Resolução a nível de estirpe: agrupamento e chamada de variantes em escala fina.
Aplicações de Casos Comprovados
Nosso Sequenciação de Amplicões por Nanoporos o serviço foi aplicado com sucesso em diversos campos de investigação. Abaixo estão exemplos selecionados que demonstram resultados práticos.
| Projeto | Objetivo da Pesquisa | Resultados Chave |
|---|---|---|
| Microbioma Aquático Urbano | Avaliar as mudanças sazonais e o impacto da poluição nas comunidades ribeirinhas. | Resolução a nível de espécie de Arcobacter e Aeromonas; revelou contribuições específicas de fontes nas estações húmidas e secas. |
| Estudo do Ambiente Interior | Caracterizar populações microbianas ligadas à ocupação humana. | Identificadas 21 espécies-chave, incluindo 11 patógenos potenciais; maior abundância de bactérias benéficas em ambientes fechados. |
| Verificação de Genes Clonais | Confirmar construções engenheiradas e sequências de plasmídeos | Consenso de alta fidelidade alcançado; redução de falsos positivos utilizando uma estratégia baseada em código de barras. |
| Microbioma Agrícola | Investigar a diversidade microbiana associada a culturas em amostras de solo. | Perfilagem de estirpes melhorada; análise de resiliência apoiada na investigação de melhoramento. |
NotaEstas aplicações são para uso apenas para pesquisa e não são destinados a procedimentos de diagnóstico.
Entregáveis
- Dados de sequenciação bruta: ficheiros FASTQ e ficheiros FASTA opcionais.
- Relatórios de QC: rendimento, distribuição do comprimento de leitura e métricas de precisão.
- Tabelas de taxonomia/variantes com perfis de abundância.
- Relatórios interativos em HTML e PDF com figuras prontas para publicação (SVG/PNG).
- Métodos de texto e parâmetros de pipeline para suportar a reprodutibilidade.
Escolhendo a Plataforma de Sequenciação Certa
A CD Genomics suporta múltiplas tecnologias de leitura longa e curta, garantindo que cada projeto receba a abordagem mais adequada. Quer o seu objetivo seja a deteção de variantes com alta precisão, a análise de amplicões de comprimento total ou estudos em escala populacional, podemos recomendar a plataforma certa.
| Recurso | PacBio SMRT | Oxford Nanopore | Illumina |
|---|---|---|---|
| Comprimento de leitura | Longo (10–25 kb; HiFi ~15–20 kb) | Ultra-longo (intervalo de kb a Mb) | Curto (100–500 pb) |
| Precisão | Muito alto (HiFi >99,9%) | Alto com consenso/supressão de erros | Muito alto (>99,9%) |
| Reviravolta | Moderado | Flexível, portátil, em tempo real | Alto rendimento, baseado em lotes |
| Forças | Baixo erro, ideal para regiões repetitivas | Leituras mais longas, amplicões a nível de espécie, RNA/DNA direto | Custo-efetivo para grandes coortes |
| Limitações | Custo mais elevado, qualidade do ADN crítica | Taxa de erro bruta mais alta sem correção | Resolução limitada para repetições longas |
| Mais adequado para | Assemblagens de novo, regiões repetitivas | Amplicões, microbiomas, análise rápida | Deteção de SNP, estudos com grandes amostras |
O nosso compromisso:
Prestamos serviços de sequenciação em todas as três plataformas—PacBio, Oxford Nanopore e Illumina—portanto, não precisa preocupar-se em escolher o método errado. Os nossos especialistas avaliam as suas amostras e objetivos de investigação, e depois recomendam a plataforma que maximiza a qualidade dos dados, a eficiência e a relação custo-eficácia.
Requisitos de Amostra para Sequenciação de Amplicões com Nanoporos
| Tipo de Amostra | Entrada Recomendada | Pureza (OD260/280) | Requisitos | Notas |
| Produtos de PCR Purificados | ≥1 μg (mín. 500 ng) | 1,8–2,0 | ≥20 ng/μL; alta qualidade; tamanho compatível com as especificações da plataforma | Banda única e específica; sem produtos não específicos. |
| Produtos de PCR Não Purificados | Variável | — | Aceitável, mas a purificação é fortemente recomendada para uma qualidade de sequenciação ideal. | — |
| DNA fragmentado | Quantidade suficiente | — | Requer tamanho uniforme e compatibilidade com a região-alvo. | Para estratégias de amplicão específicas |
| DNA genómico (gDNA) | ≥500 ng | 1,8–2,0 | Alta pureza; ≥20 ng/μL; sem degradação | Ideal para amplificação baseada em PCR |
- Todas as amostras de ADN devem passar por testes de pureza e concentração para garantir a qualidade do sequenciamento.
- Se tiver questões sobre a preparação de amostras ou precisar de um plano personalizado, sinta-se à vontade para nos contactar a qualquer momento para assistência especializada.
Por que escolher a CD Genomics para sequenciação de amplicões com Nanopore?
Desde plataformas de sequenciação avançadas até à entrega de dados de alta qualidade, a CD Genomics oferece uma solução eficiente, de ponta a ponta, adaptada a diversas necessidades de investigação. Quer esteja a estudar variantes raras ou a sequenciar DNA antigo, a nossa equipa garante resultados fiáveis com um suporte flexível.
- EspecializaçãoA nossa equipa tem uma profunda experiência na utilização da tecnologia da Oxford Nanopore para diversas aplicações de sequenciação.
- Tecnologia de pontaUtilizamos os mais recentes avanços em sequenciação por nanoporo para fornecer os melhores resultados possíveis.
- Soluções Personalizáveis: Adaptamos cada projeto às necessidades específicas dos nossos clientes, garantindo resultados relevantes e de alta qualidade.
- Tempo de Resposta RápidoCom capacidades de sequenciação em tempo real, fornecemos insights rápidos para manter a sua investigação no caminho certo.
- Apoio AbrangenteDesde a preparação da amostra até à análise de dados, oferecemos apoio completo durante todo o processo de sequenciação.
Resultados da Demonstração
Demonstração de Resultados
As leituras de nanopore abrangem as regiões completas de 16S/ITS, enquanto as plataformas de leituras curtas estão limitadas a segmentos parciais.
Melhoria da Resolução Taxonómica
A sequenciação de amplicões por nanopore melhora significativamente a atribuição a nível de espécie em comparação com métodos de leituras curtas.
Precisão de Consenso com Supressão de Erros
Fluxos de trabalho avançados de correção de erros reduzem falsos positivos e a formação de quimeras, garantindo um consenso de alta fidelidade.
Análise da Diversidade da Comunidade
A análise da beta-diversidade permite uma clara separação das comunidades microbianas entre grupos de amostras.
FAQs sobre sequenciação de amplicões por nanopore
Q1. O que distingue o sequenciamento de amplicões por Nanopore dos métodos de leitura curta da Illumina?
O Nanopore fornece leituras de comprimento total (por exemplo, 16S V1–V9 ou ITS completo), permitindo resolução a nível de espécie ou estirpe. As leituras da Illumina são mais curtas (por exemplo, V3–V4) e podem classificar erroneamente as espécies ou perder detalhes a nível de estirpe.
Q2. Quando é necessária a correção de erros baseada em código de barras (etiquetagem única)?
Use-o quando:
- você requer uma precisão muito alta (por exemplo, deteção de variantes em amostras clonais ou mistas),
- alvo de amplicões longos propensos a erros de sequenciação ou PCR,
- investigando táxons raros.
Q3. Quantas leituras por amostra são recomendadas?
- Para a caracterização da comunidade: ≥ 50.000 leituras/amostra para saturar a diversidade em amostras de complexidade moderada.
- Para amplicões clonais: são necessárias menos leituras, uma vez que o foco está na precisão do consenso em vez da riqueza.
Q4. Quais fatores afetam mais a qualidade dos dados?
- Entrada de DNA: quantidade, pureza (razões OD), integridade (tamanho dos fragmentos).
- Especificidade da PCR: amplificações limpas de banda única.
- Manuseio de amostras: evitar ciclos de congelamento e descongelamento, contaminação, inibidores.
Q5. Com que rapidez receberei os resultados?
O tempo de resposta depende do tipo de projeto e da qualidade da amostra. Projetos clonais são geralmente mais rápidos, enquanto estudos comunitários podem demorar mais devido a etapas de análise adicionais.
Q6. Os resultados são adequados para publicação ou uso regulatório?
Sim, para uso apenas para pesquisaFornecemos relatórios de qualidade de publicação, detalhes de métodos e bases de dados de taxonomia versionadas. No entanto, este serviço não é certificado para diagnósticos.
Q7. Quais bases de dados de referência internas são utilizadas para a atribuição taxonómica?
Utilizamos bases de dados de referência completas de 16S/ITS, cuidadosamente selecionadas e atualizadas regularmente, para garantir uma melhor atribuição a nível de espécie e uma mínima má classificação.
Q8. Posso sequenciar múltiplos alvos genéticos ou loci numa única amostra?
Sim, desde que as ampliações de PCR sejam específicas (um produto distinto por alvo). Amplicões mistos ou não específicos reduzem a precisão e podem exigir corridas separadas ou fluxos de trabalho personalizados.
Estudos de Caso de Sequenciação de Amplicões com Nanoporos
Contexto do Cliente
Pesquisadores de Universidade TU Dortmund (Alemanha) e Universidade Nacional do Sul (Argentina) investigou o actinobactério Streptomyces albus CAS922. Esta estirpe foi isolada de cascas de sementes de girassol e apresentou um forte potencial para degradação da lignocelulose e biossíntese de metabolitos secundáriosPara explorar a sua capacidade metabólica e relevância industrial, a equipa necessitou de um sequência genómica completa de alta qualidade.
Desafio
- Os actinobactérias contêm tipicamente genomas grandes e ricos em GC (>70%), o que complica o sequenciamento e a montagem.
- As tecnologias de leitura curta frequentemente produzem montagens fragmentadas com repetições não resolvidas, limitando a análise subsequente de clusters de genes biossintéticos (BGCs) e enzimas ativas em carboidratos (CAZymes).
- O cliente precisava de uma abordagem que pudesse gerar leituras longas e contíguas e suportar uma anotação precisa para a pesquisa em genómica funcional.
A Nossa Solução
- A CD Genomics realizou sequenciação de long-read da Oxford Nanopore utilizando o kit de ligadura SQK-LSK109.
- Geração de dados: Mais de 1,5 Gb de dados limpos a partir de >260.000 leituras, com um comprimento de leitura N50 de ~8 kb.
- Estratégia de montagem: Montagem de novo com Canu, seguida de polimento com Pilon para aumentar a precisão.
- Ferramentas de anotação: NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline (PGAP) para chamada de genes; RepeatMasker para elementos repetitivos; CAZy/dbCAN2 para previsão de enzimas ativas em carboidratos; antiSMASH para deteção de clusters biossintéticos.
Resultados
- Um cromossoma linear completo de 8,06 Mb foi montado, alcançando uma cobertura de ~191× e um conteúdo de GC de 72,6%.
- Foram identificados 6.776 genes codificadores de proteínas e 80 RNAs.
- Foram previstos 232 enzimas ativas em carboidratos, incluindo três enzimas dependentes de cobre implicadas na degradação da celulose e do xilano.
- Foram revelados 27 clusters de genes biossintéticos, codificando metabolitos como sideróforos (desferrioxamina E), terpenos (cyslabdano, geosmina) e antibióticos (xantolipina, pseudouridimicina).
Impacto
- O genoma de alta qualidade permitiu uma compreensão funcional a nível de estirpe na degradação da lignocelulose, apoiando o desenvolvimento de aplicações de biomassa renovável.
- A descoberta de diversos clusters biossintéticos destacou o potencial biotecnológico de S. albus CAS922 para a produção de novos antibióticos e compostos bioativos.
- O projeto demonstrou como o serviço de sequenciação Nanopore da CD Genomics pode resolver genomas complexos com alto conteúdo de GC e fornecer informações biológicas acionáveis.
Referências:
- Tippelt A, Nett M, Vela Gurovic MS. Sequência Genómica Completa do Actinobactéria Degradadora de Lignocelulose Streptomyces albus CAS922. Anúncios de Recursos Microbiológicos. 2020, 21 de maio;9(21):e00227-20. doi: 10.1128/MRA.00227-20. PMID: 32439662; PMCID: PMC7242664.
- Sun B, Bhati KK, Song P, Edwards A, Petri L, Kruusvee V, Blaakmeer A, Dolde U, Rodrigues V, Straub D, Yang J, Jia G, Wenkel S. A metilação do 3'UTR do FLC mediada por FIONA1 afeta os níveis de transcritos do FLC e a floração em Arabidopsis.. PLoS Genética. 2022 Set 27;18(9):e1010386. doi: 10.1371/journal.pgen.1010386. PMID: 36166469; PMCID: PMC9543952.
