Análise de Amplicão Longo (AAL)

A CD Genomics oferece um serviço LAA profissional e rentável, com profundidade de sequenciação variando de <500 a 10K CCSs por amostra, para atender às suas necessidades específicas de pesquisa.

A Introdução à Análise de Longos Amplicões

A Análise de Amplicões Longos (LAA) é uma técnica de biologia molecular concebida para investigar e analisar sequências de DNA extensas. Esta estratégia amplifica principalmente fragmentos longos de DNA genómico através da Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR) antes da sequenciação e interpretação de dados subsequentes. Este método tem aplicações significativas em genómica, biologia evolutiva, investigação de doenças, juntamente com outros campos que necessitam de pesquisa sobre a estrutura e variações complexas dos genes.

Com base nas Sequências de Consenso Circular (CCSs) da PacBio, a polimerase pode copiar a mesma região de DNA várias vezes, o que gera leituras longas de alta fidelidade (>99,9% de precisão de leitura de molécula única). A Análise de Amplicões Longos (LAA) utilizando Sequenciação de Molécula Única em Tempo Real (SMRT) e o Sistema Sequel produz CCSs altamente precisos e em fases a partir de longos amplicons.

Figura 1. Visão geral da tecnologia de sequenciação SMRT. (Simon Ardui, et al.., 2018)

Comparado às plataformas de sequenciação de leituras curtas, a sequenciação de leituras longas da PacBio torna mais simples sequenciar amplicões ou fragmentos capturados que variam em tamanho de várias centenas de pares de bases até 10 Kb. Estas sequências longas são muito úteis para a visualização de variantes, incluindo SNPs, CNVs e outras variantes estruturais que normalmente não requerem montagem.

Quais são as Vantagens da Análise de Longos Amplicões

• Alta Precisão: Devido ao uso de polimerases de alta fidelidade, a Análise de Amplicões Longos reduz erros durante o processo de amplificação, aumentando a fiabilidade dos resultados.
• Resolução de Regiões Complexas: A LAA pode abranger e elucidar regiões complexas e repetitivas dentro do genoma, fornecendo um conjunto mais abrangente de informações genómicas.
• Amplitude de Aplicação: A técnica é aplicável não só a genomas nucleares, mas também útil para a análise de vários tipos de ADN, incluindo ADN mitocondrial e ADN de cloroplasto.
• Alta Sensibilidade de Detecção: A Análise de Amplicões Longos pode identificar e detetar grandes inserções/deleções, inversões e translocações, aumentando assim a sensibilidade da deteção de variações genómicas complexas.
• Alta Resolução Haplótipica: Sequenciação de leitura longa pode identificar e diferenciar entre vários haplótipos do mesmo indivíduo dentro de um único amplicão, fornecendo informações detalhadas sobre a estrutura e as variações dos haplótipos.
• Cobertura Completa do Comprimento do Gene: Para mutações que envolvem múltiplos exões ou genes inteiros, a LAA pode cobrir regiões inteiras do gene, garantindo que nenhuma mutação chave seja perdida.
• Processo de Montagem Simplificado: A capacidade de leitura longa abrange regiões genómicas maiores, reduzindo incompatibilidades e redundâncias durante o processo de montagem, tornando os resultados da montagem precisos e fiáveis.

Quais são as aplicações da Análise de Longos Amplicões?

• Sequenciação de genes 16S/18S/ITS de comprimento completo
• Comprido Tipagem HLA
• Haplotipagem alternativa
• De novo montagem do gene alvo
• Personalizado sequenciação de amplicons

Fluxo de Trabalho de Análise de Amplicões Longos

Especificação do Serviço

	Requisitos de Amostra 2 µg ou mais de amplicões (ou seja, Produtos de PCR purificados) com uma concentração de ~50ng/µl ou superior, devem ser dissolvidos em tampão Tris-HCl (10 mM, pH 8) e enviados em pacotes de gelo seco. Também oferecemos serviço de preparação de amplicons, a partir de materiais iniciais, incluindo ADN genómico, pellets celulares e tecidos.
	Sequenciação Sequenciação PacBio plataforma amplicões de 3 kb a >10 kb >99,999% de precisão
	Análise Bioinformática Para sequenciação de genes 16S/18S/ITS de comprimento total: Agrupamento e filtragem de OTUs Análise de OTUs e anotação de espécies Diversidade alfa, diversidade beta, meta-análise Análise estatística multivariada Para outras aplicações, por favor, informe-se.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes na Análise de Longos Amplicões para a sua escrita (personalização)

Referências:

1. Simon Ardui, et al.(2018) Sequenciação em tempo real de molécula única (SMRT) atinge a maturidade: aplicações e utilidades para diagnósticos médicos. Pesquisa em Ácidos Nucleicos46(5) 2159–2168.
2. Joshua P. Earl, et al.(2018) Perfilagem da comunidade bacteriana a nível de espécie do microbioma sinonasal saudável utilizando sequenciação da Pacific Biosciences de genes 16S rRNA de comprimento completo. Microbioma. 6.
3. Henk P.J. Buermans, et al.(2017) Sequenciação PacBio de Amplicões Longos do CYP2D6 Flexível e Escalável. Mutação Humana38(3) 310–316.
4. Frans, Glynis, et al.(2018) Método de sequenciação convencional e de molécula única direcionado para a deteção específica de variantes no IKBKG, contornando o pseudogene IKBKGP1. O Jornal de Diagnósticos Moleculares 20(2): 195-202.

Resultados da Demonstração

(Frans et al.., 2018)

Perguntas Frequentes sobre Análise de Longos Amplicões (LAA)

1. Quais são as principais áreas de aplicação da Análise de Longos Amplicões?

A Análise de Amplicões Longos encontra ampla aplicação em uma variedade de áreas de pesquisa, que incluem:

• Estudos sobre Variações Estruturais Genómicas: É utilizado para analisar variações complexas que abrangem inserções significativas, deleções, inversões e sequências repetidas.
• Pesquisa sobre Doenças Genéticas: Esta ferramenta ajuda na identificação de mutações complexas que envolvem regiões genómicas alongadas associadas ao diagnóstico clínico.
• Estudos sobre Evolução e Filogenia: A Análise de Longos Amplicões permite explorar as variações genéticas entre espécies, lançando luz sobre as relações evolutivas.
• Investigação sobre a Diversidade Microbiana: É utilizada para investigar a estrutura do genoma completo de comunidades microbianas em várias amostras ambientais.

2. Qual é o fluxo de trabalho básico da Análise de Longos Amplicões?

Os processos fundamentais que sustentam a Análise de Longos Amplicões começam com a extração e purificação de DNA. A operação envolve a isolação de DNA de qualidade óptima a partir das amostras fornecidas. Segue-se um processo de amplificação por PCR, onde primers específicos são utilizados em conjunto com polimerases de alta fidelidade para intensificar segmentos-alvo.

Subsequentemente, o processo de purificação do amplicon ocorre, no qual o DNA não amplificado residual e os dímeros de primers são eliminados. Isto leva à etapa de preparação da biblioteca e a uma verificação de controlo de qualidade. Aqui, são preparadas bibliotecas compatíveis com plataformas de sequenciação e é realizada uma rigorosa verificação de qualidade para garantir a sua adequação para os procedimentos subsequentes.

Sequenciação de alto rendimento é a próxima fase chave que faz uso de plataformas como a PacBio e Oxford Nanopore adepto para sequenciação de leitura longaApós a etapa de sequenciação, é realizada uma análise de dados abrangente. Esta análise abrange controlo de qualidade, alinhamento, deteção de variantes e anotação funcional.

Antes de os dados serem armazenados e disponibilizados para distribuição, há uma fase importante de validação e reporte dos resultados. As principais conclusões são verificadas experimentalmente e são gerados relatórios de análise abrangentes. Como passo final, os dados são armazenados de forma segura em bases de dados, após o que são tornados acessíveis para partilha, de acordo com os requisitos da investigação.

3. Quais são as ferramentas comumente utilizadas na análise de dados de Análise de Longos Amplicões?

As ferramentas utilizadas na análise de dados incluem:
Controlo de qualidade: FastQC, Trimmomatic, Cutadapt.
Alinhamento e montagem: BWA, Bowtie2, Minimap2, Canu, Flye.
Deteção de variantes: GATK, FreeBayes, Manta, LUMPY.
Anotação funcional: ANNOVAR, SnpEff.

4. Como garantir a precisão e fiabilidade dos resultados da Análise de Longos Amplicões?

Vários protocolos metodológicos podem ser implementados para aumentar a precisão e a fiabilidade, tais como:

• Extração e Purificação de DNA: A implementação de kits sofisticados, juntamente com a execução meticulosa do procedimento, pode facilitar a extração e purificação de DNA de alta qualidade.
• Otimização das Condições de PCR: O ajuste fino de condições específicas dentro do processo de reação em cadeia da polimerase (PCR), como a temperatura de anelamento e o tempo de extensão, pode ajudar a garantir uma amplificação eficiente dos segmentos.
• Utilização de Polimerases de Alta Fidelidade: A aplicação de polimerases de alta fidelidade desempenha um papel importante na minimização das chances de discrepâncias na amplificação.
• Controlo de Qualidade Atento: Devem ser observadas medidas rigorosas de controlo de qualidade em pontos críticos durante as fases de sequenciação e análise de dados.
• Validação Experimental: Resultados fundamentais devem ser validados experimentalmente. Isso pode envolver métodos como Sequenciação de Sanger ou PCR quantitativa (qPCR).

Estudos de Caso de Análise de Longos Amplicões (LAA)

Definição de Alelos de Referência do Gene do Grupo Sanguíneo por Sequenciação de Longa Leitura: Prova de Conceito em ACKR1 Gene que Codifica os Antígenos Duffy

Revista: Medicina de Transfusão e Hemoterapia
Fator de impacto: 2,283
Publicado: 11 de dezembro de 2019

Fundo

Dentro do emergente campo da genómica dos grupos sanguíneos, definir e redefinir sequências de genes ou alelos de referência para vários genes de grupos sanguíneos representa objetivos significativos, tanto para aplicações diagnósticas como para explorações científicas. Dada a emergência de tecnologias de sequenciação inovadoras e poderosas, esforçámo-nos por investigar a variabilidade dos três alelos mais proeminentes de ACKR1 - o gene que codifica antígenos Duffy clinicamente críticos - ao nível do haplótipo, utilizando um sequenciação de leitura longa metodologia.

Métodos

Resultados

Os autores obtiveram leituras de sequenciamento de alta qualidade para os 162 alelos (precisão >0,999). Um total de vinte e duas variações nucleotídicas foram identificadas, que estão reportadas em bases de dados respeitáveis. Estas variações definiram 19 haplótipos: compostos por quatro em 46. ACKR1*01oito em 63 ACKR1*02e sete em 53 ACKR1*02N.01 alelos, respetivamente.

Fig. 1. Amplificação por PCR de longo alcance (LR-PCR) do todo ACKR1 locus gênico.

Tabela 1. ACKR1 variantes e haplótipos identificados por sequenciação de long-read

Conclusão

Assim, um conjunto de alelos de referência específicos foi estabelecido, utilizando tecnologia de sequenciação de terceira geração, que oferece uma exploração longitudinal detalhada de loci genéticos que se estendem por vários milhares de pares de bases. Esta nova técnica complementa as técnicas de sequenciação de segunda geração ou de leituras curtas, provando ser criticamente instrumental na decifração de alelos novos, raros e nulos.

Referência:

1. Fichou, Y., Fichou, Y., Berlivet, I., Richard, G., et al.. Definição de alelos de referência do gene do grupo sanguíneo por sequenciação de leitura longa: prova de conceito em o ACKR1 gene que codifica os antígenos Duffy. Medicina transfusional e hemoterapia, 2020, 47(1): 23-32.